Aktivering Autophagy av Aerobic Exercise i Mus

Summary

Autophagy aktivering er nyttig i forebygging av en rekke sykdommer. En av de fysiologiske fremgangsmåter for å indusere autophagy in vivo er fysisk trening. Her viser vi hvordan du kan aktivere autofagi av aerob trening og måle autofagi nivåer i mus.

Abstract

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Introduction

Autophagy er en evolusjonært konservert degradering veien, som blir indusert i respons til forskjellige stressbetingelser som sult og hypoksi ^{1, 2.} Under autofagi, dobbel-membran vesikler, kalt autophagosomes, innlemme unødvendige eller skadde subcellulære komponenter og transportere dem til lysosomer for degradering ^tre. Basal autofagi er viktig for cellulær funksjon og utvikling organisme, og svekket basal autophagy er innblandet i mange lidelser, inkludert nevrodegenerasjon, tumorigenese og type 2-diabetes ^{4, 5, 6.}

Det mest kjente fysiologiske autofagi indus er sult. Den har imidlertid to store begrensninger. For det første tar sult lang tid til effektivt å indusere autophagy i dyr, for eksempel 48 timer med mat begrensning i musi de fleste organer. For det andre, sult knapt induserer hjerne autophagy, på grunn av en forholdsvis stabil næringstilførsel i hjernen. Faktisk er det også vanskelig å oppdage autofagi induksjon av små-molekyl induktorer, som mange medikamenter ikke kan passere blod-hjerne barrieren. Således, for bedre å analysere funksjonen av autophagy aktivering i patogenesen sykdom, vi nylig oppdaget at oppgaven er en mer potent fysiologisk metode for å indusere autophagy i løpet av kort tid ^{7, 8, 9.} Sammenlignet med sult, er autofagi effektivt indusert av tredemølle å kjøre så fort som 30 min. Dermed er trening en praktisk og potent fysiologisk tilnærming for å studere mekanismen av autofagi i formidling helsemessige fordeler og forebygge sykdommer.

Det er flere protein markører for påvisning av autophagy aktivitet, blant annet LC3 og P62. LC3 (microtubule-assosiert protein 1A / 1B-light cHain 3) er et cytosolisk protein (LC3-I skjemaet), som er konjugert til PE (fosfatidyletanolamin) ved autophagy induksjon. PE-lipidert LC3 (LC3-II form) er rekruttert til autophagosomal membraner og kan brukes til å visualisere autophagosomes når merket med GFP. Dens trans fra cytosol til punktat strukturer av autophagosomes henhold mikroskopi er en indikasjon på autophagy induksjon. p62 er en last reseptor for Autophagy substrater (for eksempel ubiquitinering proteiner), og er inkorporert i autophagosomes også. Siden proteinet nedbrytes i lysosomer sammen med autophagosomes, kan nivåene brukes til å måle den autophagy fluksen. Her viser vi hvordan du bruker disse markørene for å kvantifisere autofagi i forskjellige muse vev forårsaket av aerob trening, herunder tvungen trening (tredemølle) og frivillig trening (løping hjul). De samme prosedyrer kan også bli brukt til in vivo måling av autophagy etter behandling av andre inducere.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr ble utført i henhold til retningslinjer godkjent av Northwestern University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC). 1. musemodeller Bruk 8-12 uker gamle mus i trening. For å oppdage utøves-induced autofagi in vivo, bruke GFP-LC3 transgene mus (C57BL / 6 bakgrunn) for bildediagnostikk og C57BL / 6 mus for biokjemiske analyser. 2. Anstrengelsesutløst Autophagy Setup tredemølle – tvungen tr…

Representative Results

Denne protokollen beskriver to ulike metoder for å indusere autofagi i mus vev ved aerob trening: totalt 90 min av tvungen trening på en flerfelts tredemølle satte etter to dager med akklimatisering; eller to uker med frivillig trening på en løpehjul brukt av enkelt-huset mus. I hver øvelse protokollen, kan vi måle autofagi flux av fluorescens mikroskopi og western blot analyse i ulike organer. Vi brukte en transgen mus…

Discussion

Autophagy er en katabolsk prosess som gir energi og reduserer cytotoksisitet av lysosomal degradering av cytoplasma komponenter eller skadede organeller. Studerer autofagi er viktig å forstå at reguleringen av cellulær homeostase og mekanismene for stressrespons. Nye modeller og metoder dukker opp i forskningsfeltet ^15, for å studere hvordan nedsatt autofagi bidrar til en rekke patologiske prosesser ^{16, 17.}

<p class="jove_content"…

Materials

Treadmill	Columbus Instruments	150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel	Super Pet	100079365	diameter 11.4 cm
Odometer	Bell	DASHBOARD 100
Syringe pump	KD Scientific	KDS100
Fluorescence microscope	Nikon	Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat	Leica	CM 1850UV
Homogenizer	IKA	003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine	CAYMAN CHEMICAL COMPANY	14194
Parafolmaldehye	SIGMA-ALDRICH	P6148	Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer
Mounting media	Vector Laboratories	H-1200
p62 antibody	BD Biosciences	610833
LC3 antibody	Novus Biologicals	NB100-2220
2X Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0737
ImageJ	NIH