رصد مفاعليه Astrocyte والانتشار في المختبر تحت ظروف أشبه بالسكتة
Summary
السكتة الدماغية هي حدثاً معقدة التي يتعرض مساهمة محددة من أستروسيتيس إلى المنطقة المتضررة من الدماغ للأوكسجين الجلوكوز الحرمان (الجزء) من الصعب على الدراسة. يقدم هذا المقال منهجية للحصول على أستروسيتيس معزولة ودراسة تفاعلية وانتشار ظروف الاستثمارات.
Abstract
السكتة الدماغية إصابة في الدماغ معقدة الناجمة عن خثرة أو صمة عرقلة تدفق الدم إلى أجزاء من المخ. وهذا يؤدي إلى الحرمان من الأوكسجين والجلوكوز، مما يتسبب في فشل الطاقة وموت الخلايا العصبية. بعد إهانة السكتة الدماغية، يصبح رد الفعل astrocytes وتتكاثر حول موقع الإصابة كما أنه يتطور. وبموجب هذا السيناريو، من الصعب دراسة مساهمة محددة من أستروسيتيس إلى منطقة الدماغ يتعرض إلى الاسكيمية. ولذلك، يقدم هذا المقال منهجية لدراسة مفاعليه astrocyte الأولية والانتشار في إطار نموذج في المختبر لبيئة مثل الاسكيمية، يطلق الأكسجين الجلوكوز الحرمان (الجزء). أستروسيتيس كانت معزولة من يوم 1-4-الفئران حديثي الولادة القديمة والعدد غير محدد من الخلايا أستروسيتيك وقيمت باستخدام علامة astrocyte انتقائية البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني) وتلطيخ النووية. يمكن تخصيص الفترة التي astrocytes يتعرضون لحالة الاستثمارات، فضلا عن النسبة المئوية للأوكسجين فهي تتعرض ل. هذه المرونة يسمح للعلماء لوصف مدة الشرط الدماغية تشبه في مجموعات مختلفة من الخلايا في المختبر. تتناول هذه المقالة الأطر الزمنية للاستثمارات التي تحفز مفاعليه astrocyte ومورفولوجيا الضخامي والانتشار كما تقاس الفلورة استخدام تنتشر مستضد النووية الخلية (منها). إلى جانب الانتشار، astrocytes الخضوع للطاقة، والأكسدة، وتستجيب للاستثمارات عن طريق الإفراج عن عوامل قابلة للذوبان في المتوسط الخلية. ويمكن جمع هذه الوسيلة والمستخدمة لتحليل آثار الجزيئات الصادرة عن أستروسيتيس في الثقافات الخلايا العصبية الأولية دون تدخل من خلية إلى خلية. في ملخص، يمكن استخدام هذا النموذج ثقافة الخلية الابتدائية كفاءة لفهم دور astrocytes المعزولة عند الإصابة.
Introduction
ويعرف “الحادة العصبية اختلال وظيفي المنشأ الأوعية الدموية مع التطور السريع أو المفاجئ من الأعراض والعلامات، المقابلة لمشاركة المجالات المحورية في الدماغ”1،2السكتة الدماغية. هناك نوعان من السكتة الدماغية: النزفية والدماغية. عند الخلل في الأوعية الدموية بسبب تمدد الأوعية الدموية أو عطل، مصحوبة بضعف مع تمزق الخلفي للشريان، وهذا هو ما يسمى السكتة الدماغية النزفية3 التي، في معظم الحالات، يؤدي إلى الموت. عند خثرة أو صمة يعوق تدفق الدم، يسبب حرمان مؤقت من الأوكسجين والجلوكوز إلى منطقة الدماغ، فإنه يسمى السكتة الدماغية4. فشل لتغذية الخلايا حول المنطقة المتضررة أو الدماغية الأساسية يؤدي إلى اختلال التماثل الساكن والتمثيل الغذائي والخلل نشطة، وموت الخلايا العصبية، والتهاب5، الذي يمكن أن يؤدي إلى إعاقة مدى الحياة للمرضى6.
السكتة الدماغية هو إصابة المتعددة العوامل التي تنطوي على عدة أنواع من الخلايا التي تتفاعل وممارسة آثارها في نقاط زمنية مختلفة. إنشاء العديد من التفاعلات بيئة صعبة لدراسة سلوك الخلايا الفردية. لذا، كيف يمكننا دراسة المساهمة من نوع الخلية المحددة ضمن هذه بيئة معقدة؟ يتكون نموذج مقبولة في المختبر من الاسكيمية تعريض الخلايا للحرمان من الأوكسجين والجلوكوز (الجزء)، لفترة زمنية معينة، تليها استعادة الخلايا على بيئة نورموكسيك. يحاكي هذا النظام والسكتات دماغية تليها ضخه الدم. في هذا الأسلوب، تتعرض الخلايا أو الأنسجة إلى وسائط خالية من السكر في بيئة إزالة الأوكسجين، استخدام دائرة التاكسج متخصصة. يمكن أن تختلف فترة حضانة المرض الجزء من بضع دقائق يصل إلى 24 ح، اعتماداً على فرضية أن يريد أن يكون اختبار. وقد أظهرت الدراسات أن تبعاً لأوقات الجزء والبيئة نورموكسيك، تعمل محددة من السكتة الدماغية (أيالحاد أو الفمية) يمكن أن يتحقق. الابتدائي astrocytes معزولة، يتعرض للاستثمارات مع استعادة الخلفي لظروف نورموكسيك، ونموذج خلوية مدروسة تحاكي السكتة الدماغية في المختبر7. استخدام الجزء من الممكن الكشف عن الآليات الجزيئية مستقلة من الخلايا المعزولة تحت بيئة شبيهة بالسكتة الدماغية.
كما يزيد من معرفتنا بعلم الأحياء أستروسيتي، أصبح من الواضح أنها حاسمة للحفاظ على نقاط الاشتباك العصبي واستدامة التنمية وإصلاح، واللدونه العصبية8. تحت الظروف العادية، الإفراج عن astrocytes والرد على السيتوكينات والمستقطبات وعوامل النمو وجليوترانسميتيرس، الحفاظ على توازن التمثيل الغذائي والتوازن داخل نهايات5،9. في neuroinflammation الحادة، مثل السكتة الدماغية، هذه الخلايا يمكن أن يصبح رد الفعل تظهر أوفيريكسبريشن طويلة الأجل من البروتين حمضية فيبريلاري الدبقية (توصيني) وإظهار تضخم في بهم مورفولوجيا5،10، 11 , 12-تطور احتشاء الدماغية، التوازن تقدمه astrocytes يصبح المتضررة، فيما يتعلق بامتصاص الغلوتامات العادي، واستقلاب الطاقة، وتبادل الجزيئات النشطة، ومضادات الأكسدة نشاط13.
Astrocytes المعاد تنشيطها تتكاثر حول الأنسجة احتشاء في حين تهاجر الكريات البيضاء نحو المنطقة ليسيونيد14. ويمكن قياس انتشار أستروسيتيك باستخدام علامات مثل تكاثر الخلايا النووية مستضد (منها) و Ki67 وبروموديوكسيوريديني (بردو)15. يتم إنشاء هذه الاستجابة التكاثري بطريقة تعتمد على الوقت ويساعد على تشكيل ندبة الدبقية، صفيف أستروسيتيس رد الفعل لا رجعة فيه على طول حمة الموقع معطوب بعد إصابة9. واحدة من أولى مهام هذا الندبة الحد من التسرب الخلايا المناعية من هذه المنطقة. ومع ذلك، وقد أظهرت الدراسات أن الندبة يصبح عائقا مادية لمحاور عصبية تمديد، كما أنها تفرج عن الجزيئات التي تحول دون نمو محواري، وإنشاء حاجز مادي يحول دون توسيع نطاق حول المنطقة المضرورة16محاور عصبية. ومع ذلك، هناك أدلة علمية تبين أن بعد إصابة حبل الشوكي، تماما منع تشكيل ندبة الدبقية يمكن أن يضر بالتجديد لمحاور عصبية17. وبالتالي، يجب النظر في السياق الذي يتم قياس استجابة أستروسيتيك محددة، بناء الإطار للضرر الذي درس.
يمكن تطبيق المنهجية المقدمة لدراسة وظيفة فردية astrocytes بعد الأكسجين الجلوكوز الحرمان ومن الممكن تعديله تبعاً للأسئلة التي يريد المحقق للإجابة. على سبيل المثال، إلى جانب علامات المعرب عنها في أوقات مختلفة من الاستثمارات وتغيير الخصائص المورفولوجية، supernatants من astrocytes يتعرضون للجزء يمكن كذلك تحليل لتحديد العوامل القابلة للذوبان صدر عن هذه الخلايا، أو استخدامها كوسائل الإعلام مكيفة لتقييم ما التأثير في خلايا الدماغ الأخرى. ويمكن هذا النهج دراسات حول مفاعليه أستروسيتي التي يمكن أن تؤدي إلى الكشف عن العوامل التي تحكم وتعدل استجابتها في سيناريو السكتة الدماغية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول عزل أستروسيتيس من كورتيسيس الفئران. في هذا الأسلوب، من المهم لتقليل التلوث بأنواع الخلوية الأخرى مثل ميكروجليا، أوليجوديندروسيتيس، والخلايا الليفية. لتقليل عدد microglia، يمكن اتخاذ عدة خطوات: تغيير الإعلام والمداري تهتز، والعلاجات الكيميائية. مجرد تأكيد ثقافة النقاء ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أريد أن أشكر بيرالدي لوبيز باولا للمساعدة التقنية. A.H.M. تشعر بالامتنان للمنح 8G12MD007600 و NS083924 U54 معتمدة من هذا المنشور. ونحن نشكر المعاهد الوطنية للصحة-نيمهد-G12-MD007583 منحة لدعم مرفق. D.E.R.A. تشعر بالامتنان للزمالة المقدمة من نيهنيجمس-R25GM110513. ونحن ممتنون لاستخدام “منطقة الأجهزة المشتركة” ومنح المعونة من الدكتورة بريسيلا سانابريا لاستخدام مرفق التصوير الضوئي للبرنامج ركمي ب G12MD007583. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر خوسيه باديلا لدورة البارز في تصوير وتحرير البروتوكول البصرية.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
Riferimenti
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases. Front Cell Neurosci. 9, 278 (2015).
- Broderick, J., et al. Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).
- Wang, R., et al. Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes. PLoS One. 7 (5), e37574 (2012).
- Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes in neural repair and protection. The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).
- Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PLoS One. 8 (3), e60282 (2013).
- Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
- Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury. Neural Plast. , 1347987 (2016).
- Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat. Neurochem Res. , (2016).
- Cekanaviciute, E., et al. Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice. Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).
- Zhu, Z., et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo. Glia. 55 (5), 546-558 (2007).
- Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes. Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).
- Anderson, M. A., et al. Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration. Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).
- Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells. Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).
- Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26 (2007).
- Giulian, D., Baker, T. J. Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain. J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16 (3), 282-292 (1998).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
- Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. Depletion of microglia from primary cellular cultures. Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).
- Svensson, M., Aldskogius, H. Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation. Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).
- Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside. J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).
- Nakatsuji, Y., Miller, R. H. Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes. J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).
- Reeves, J. P. Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters. J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).
- Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques. Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).
- Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).
- Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. J Vis Exp. (54), (2011).
- Rivera-Aponte, D., et al. Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake. Neuroscienze. 310, 216-223 (2015).
- Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation. Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).
- Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices. Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).
- Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices. Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).
