Überwachung der Astrozyten Reaktivität und Proliferation in Vitro unter ischämischen-ähnlichen Bedingungen
Summary
Ischämischen Schlaganfall ist schwer zu lernen ist ein komplexer Vorgang, in dem der spezifische Beitrag der Astrozyten, die betroffene Hirnregion Glukose Sauerstoffmangel (OGD) ausgesetzt. Dieser Artikel stellt eine Methode zur isolierte Astrozyten zu erhalten und ihre Reaktivität und Verbreitung unter OGD Bedingungen zu studieren.
Abstract
Ischämischen Schlaganfall ist eine komplexe-Hirn-Trauma durch einen Thrombus oder Lungenembolie behindern Blutfluss in Teilen des Gehirns verursacht. Dies führt zur Entziehung von Sauerstoff und Glukose, die Energie Versagen und neuronalen Tod verursacht. Nach eine Beleidigung des ischämischen Schlaganfalls Astrozyten werden reaktive und vermehren sich um die Verletzung Aufstellungsort, wie es sich entwickelt. In diesem Szenario ist es schwierig, den spezifischen Beitrag der Astrozyten, die Region des Gehirns ausgesetzt Ischämie zu studieren. Dieser Artikel stellt daher eine Methode zur primären Astrozyten Reaktivität und Verbreitung unter einem in Vitro Modell einer Ischämie-ähnlichen Umgebung, genannt Glukose Sauerstoffmangel (OGD) zu studieren. Astrozyten wurden isoliert von 1-4 Tage-alten Neugeborenen Ratten und die Anzahl der unspezifischen astrocytic Zellen wurde anhand Astrozyten selektive Marker Glial Fibrillary sauren Protein (GFAP) und nukleare Färbung. Der Zeitraum, in dem Astrozyten OGD Zustand ausgesetzt sind, sowie der Sauerstoffgehalt anpassbar, denen sie ausgesetzt sind. Diese Flexibilität ermöglicht es Wissenschaftlern, die Dauer der ischämischen-ähnlichen Zustand in verschiedene Gruppen von Zellen in Vitrozu charakterisieren. Dieser Artikel beschreibt die Zeitrahmen von OGD, die Astrozyten Reaktivität, hypertrophe Morphologie und Verbreitung gemessen durch Immunfluoreszenz mit wuchernden Cell Nuclear Antigen (PCNA) induzieren. Neben der Verbreitung Astrozyten Energie- und oxidativen Stress zu unterziehen, und reagieren auf OGD durch Loslassen lösliche Faktoren in der Zelle-Medium. Dieses Medium kann gesammelt und verwendet, um die Auswirkungen von Molekülen veröffentlicht von Astrozyten im neuronalen Primärkulturen ohne Zell-Zell-Interaktion zu analysieren. Zusammenfassend lässt sich sagen diese Primärzelle Kulturmodells effizient einsetzbar zu verstehen, die Rolle der isolierten Astrozyten auf Verletzungen.
Introduction
Schlaganfall ist definiert als “eine akute neurologische Dysfunktion vaskulären Ursprungs mit plötzlichen oder schnelle Entwicklung der Symptome und Zeichen, entsprechend der Beteiligung der Schwerpunkte im Gehirn”1,2. Es gibt zwei Arten von Schlaganfällen: ischämische und hämorrhagische. Wenn vaskuläre Dysfunktion verursacht wird, entweder durch ein Aneurysma oder eine arteriovenöse Fehlfunktion, begleitet durch eine Schwächung mit hinteren Ruptur einer Arterie ist dies hämorrhagischer Schlaganfall3 bezeichnet, die in den meisten Fällen zum Tod führt. Wenn ein Thrombus oder eine Lungenembolie Blutfluss behindert, verursacht eine vorübergehende Entziehung von Sauerstoff und Glukose zu einer Region des Gehirns, ischämischen Schlaganfall4heißt es. Bei Nichtbeachtung nähren Zellen um das betroffene Gebiet oder ischämischen Kern führt zu eine homöostatische und metabolische Ungleichgewicht, energetische Dysfunktion, neuronalen Tod und Entzündung5, die eine lebenslange Behinderung für Patienten6auslösen können.
Ischämischen Schlaganfall ist eine multifaktorielle Verletzungen, an denen verschiedene Arten von Zellen, die reagieren und üben ihre Wirkungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Viele Interaktionen erstellen ein schwierigen Umfelds um das Verhalten einzelner Zellen untersuchen. Also, wie wir den Beitrag von einem bestimmten Zelltyp unter einem komplexen Umfeld zu studieren? Eine anerkannter in-vitro- Modell der Ischämie besteht aus auszusetzen Zellen Sauerstoff und Glukose Deprivation (OGD), für einen bestimmten Zeitraum, gefolgt von der Wiederherstellung der Zellen zu einer inklusieve Umgebung. Dieses System simuliert einen ischämischen Schlaganfall gefolgt von Blut Reperfusion. Bei dieser Methode sind Zellen oder Geweben eine Glukose-freie Medien in einem Umfeld von Sauerstoff, mit einer spezialisierten hypoxischen Kammer gesäubert ausgesetzt. Die OGD Inkubationszeit variiert von wenigen Minuten bis zu 24 Stunden, abhängig von der Hypothese, die getestet werden will. Studien haben gezeigt, dass je nach den Zeiten der OGD und inklusieve Umwelt, bestimmten Phänotypen eines Schlaganfalls (d.h.akute oder subchronische) erreicht werden. Primäre isolierte Astrozyten, OGD mit hinteren Restaurierung inklusieve Bedingungen ausgesetzt ist ein gut untersuchten zellulären Modell, Schlaganfall in-vitro-7zu imitieren. OGD ist möglich, die unabhängige molekularen Mechanismen der isolierten Zellen unter einem Schlaganfall-ähnliche Umgebung zu offenbaren.
Mit zunehmender unser Wissen der Astrozyten Biologie deutlich geworden, dass sie entscheidend für die Aufrechterhaltung der Synapsen und Aufrechterhaltung neuronaler Plastizität, Reparatur und Entwicklung8sind. Unter normalen Bedingungen Astrozyten freizugeben und reagieren auf Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren und Gliotransmitters, metabolic-Balance und Homöostase innerhalb von Synapsen5,9zu halten. In akuten Neuroinflammation, wie ischämischen Schlaganfall können diese Zellen reaktive werden, zeigen eine langfristige Überexpression des Glial Fibrillary sauren Protein (GFAP) und zeigen Hypertrophie in ihrer Morphologie5,10, 11 , 12. wie der ischämischen Infarkt entwickelt, die Homöostase von Astrozyten bereitgestellt wird betroffen, bei normalen Glutamat-Aufnahme, Energiestoffwechsel, Austausch von aktiven Molekülen und antioxidative Aktivität13.
Reaktivierte Astrozyten vermehren um das Infarkt-Gewebe während Leukozyten in Richtung der lesioned Bereich14migrieren. Astrocytic Verbreitung kann mit Hilfe von Markern wie wuchernden Cell nuclear Antigen (PCNA), Ki67 und Bromodeoxyuridine (BrdU)15gemessen werden. Diese proliferative Reaktion wird in einer zeitabhängigen Weise erzeugt und es hilft bilden die glial Narbe, ein Array von irreversibel reaktive Astrocyten entlang das Parenchym der beschädigten Seite nach einer Verletzung-9. Eine der ersten Funktionen dieser Narbe ist die Immunzelle Extravasation aus diesem Bereich zu begrenzen. Studien haben jedoch gezeigt, dass die Narbe ein physisches Hindernis für Axone wird zu erweitern, wie sie release-Moleküle axonale Wachstum hemmen, und erstellen Sie eine physische Barriere, die verhindert, dass Axone erweitern um den verletzten Bereich16. Dennoch gibt es wissenschaftliche Beweise dafür, dass nach einer Rückenmarksverletzung ganz glialen Narbenbildung zu vermeiden die Regeneration der Axone17beeinträchtigen kann. So, der Kontext, in der die spezifischen astrocytic Reaktion gemessen wird, muss auf dem Rahmen der Verletzung studierte berücksichtigt werden.
Die vorgestellte Methode kann angewendet werden, um die individuelle Funktion der Astrozyten nach Glukose Sauerstoffmangel zu untersuchen und es kann geändert werden, je nach Fragestellung, die der Prüfer beantworten will. Z. B. neben der morphologischen Veränderungen und die Marker OGD zeitversetzt zum Ausdruck gebracht, die Überstände von Astrozyten OGD ausgesetzt können analysiert werden, weiter um lösliche Faktoren von diesen Zellen freigegeben wird, oder als konditionierten Medium zur Beurteilung zu identifizieren sein Wirkung in anderen Gehirnzellen. Dieser Ansatz ermöglicht Untersuchungen zur Reaktivität von Astrozyten, die die Aufklärung der Faktoren führen könnte, die Regeln und modulieren ihre Antwort in einem Szenario mit ischämischen Schlaganfall.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolation der Astrozyten aus Ratte Cortex. Bei dieser Methode ist es entscheidend, Kontamination mit anderen zellulären Arten wie Mikroglia, Oligodendrozyten und Fibroblasten zu verringern. Um die Anzahl der Mikroglia zu reduzieren, können mehrere Schritte unternommen werden: Ändern der Medien, Orbital, rütteln und chemischen Behandlungen. Wenn Kultur Reinheit durch Immunfluoreszenz mittels selektiver zellulären Marker oder für die prominentesten Zelle Verunreinigungen bestätigt ist…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Paola López Pieraldi für die technische Unterstützung zu danken. A.H.M. ist dankbar für die Zuschüsse 8G12MD007600 und U54-NS083924, die diese Publikation unterstützt. Wir danken NIH-NIMHD-G12-MD007583-Stipendium für die Anlage-Unterstützung. D.E.R.A. ist dankbar für die Gemeinschaft von NIHNIGMS-R25GM110513 zur Verfügung gestellt. Wir sind dankbar für die Nutzung des gemeinsamen Instrumentierung und Gewährung der Beihilfe von Dr. Priscila Sanabria für den Einsatz der optischen Bildgebung Anlage des Programms RCMI durch G12MD007583. Darüber hinaus wollen wir danke Jose Padilla für seine herausragende Rolle in Filmen und schneiden das visuelle Protokoll.
Materials
| Instruments for Surgery – Step 1 | |||
| Operating scissor 5.5” | Roboz Company | RS-6812 | Tools used to decapitate the rats. |
| Curved forceps 7” | Roboz Company | RS-5271 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting scissors 4” | Roboz Company | RS-5882 | Cuts both the skin and skull of the rat. |
| Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp | Roboz Company | RS-5095 | Holds the skin of the rat while the skull is removed. |
| Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Tool used to separate cortices. |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Company | RS-4972 | Peels brain meninges. |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Important for removing the meninge from the cortices. |
| DMEM Preparation – step 2 | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GibCo. Company | 11995-065 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| Filter System 1L with 0.22um pore | Corning | 431098 | |
| Astrocyte culture – step 3 | |||
| Serological pipets 5mL | VWR | 89130-896 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 10mL | VWR | 89130-898 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Serological pipets 25mL | VWR | 89130-900 | To pipette DMEM to containers with cells. |
| Centrifuge conical tube 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Safe-lock tube 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| 60mm petri dishes | Falcon | 351007 | |
| Sterile gauze pads | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturate the brain tissue. |
| Stomacher 80 Blender Sterile Bags | Sewar Lab System | BA6040 | Sterile bag for the stomacher cell homogenizer. |
| Beaker 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #60 | Sigma-Aldrich Company | S1020 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Sterile cell dissociation sieve, mesh #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | To obtain a uniform single cell suspension. |
| Invert phase microscope | Nikon | Eclypse Ti-S | Verify cells for contamination or abnormal cell growth. |
| 75cm2 sterile flasks | Falcon | 353136 | |
| Multi-well plate | Falcon | 353046 | |
| Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round | VWR | 48380-046 | |
| Bright-Line hemacytometer | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre. |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsin/EDTA | GibCo. Company | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| OGD Medium Preparation – step 5 | |||
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Supports the growth of cells. |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplement for the cell culture media. |
| Penicillin-Streptomycin | GibCo. Company | 15140-148 | Inhibits the growth of bacterias in the cell culture. |
| 200mM L-glutamine | GibCo. Company | 25030-081 | Amino acid that supplements the growth of cells. |
| Phospahet buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Filter System 50mL with 0.22um pore | Corning | 430320 | |
| Centrifuge conical tube 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Measure gas flow in oxygen purge. |
| Hypoxia Incubator Chamber | StemCell | 27310 | Generates a hypoxic environment for the cell culture. |
| Traceable Dissolved Oxygen Meter | VWR | 21800-022 | |
| 95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture | Linde | Purges the environment of oxygen. | |
| primary astrocyte immunofluorescence – step 6 | |||
| Phosphate buffer saline (PBS) tablets | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution Neutral Buffer 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution used to fix cells. |
| Methanol | Fisher | A4544 | Solution used to fix cells. |
| Non-ionic surfactant (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GibCo. Company | 10437-010 | Serum-supplement for the cell culture. |
| Anti-NeuN | Cell Signaling | 24307 | Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture. |
| Anti-PCNA | Cell Signaling | 2586 | Detects proliferating cells. |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Apoptosis staining. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Detects mature oligodendrocytes. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Detects microglial cells. |
| Anti-GFAP Conjugated with Cy3 | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Detects reactive astrocytes in the treated cells. |
| Alexa Fluor 488 | Molecular Probe Life Technology | A1101 | Anti-Mouse Secondary Antibody |
| Alexa Fluor 555 | Molecular Probe Life Technology | A21428 | Anti-Rabbit Secondary Antibody |
| 4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Nuclear staining |
| Confocal microscope | Olympus |
Riferimenti
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