تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار
Summary
الخميرة الانشطار، السكيراء pombe هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الانقسام السيتوبلازمي، والمرحلة النهائية في انقسام الخلايا. نحن هنا وصف نهج المجهري لتحليل الأحداث cytokinetic مختلفة في الخلايا الانشطار الخميرة الحية.
Abstract
السيتوبلازمي، فإن الخطوة النهائية في انقسام الخلايا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على سلامة الجينوم. السيتوبلازمي السليم مهم للتمايز الخلايا والتنمية. ويشمل السيتوبلازمي سلسلة من الأحداث التي يتم تنسيقها بشكل جيد في الزمان والمكان. ويشمل السيتوبلازمي تشكيل عصابة أكتوميوزين في موقع الانقسام، تليها انقباض حلقة، وتشكيل غشاء ثلم والاضافي الخلوي إعادة عرض المصفوفة. الخميرة الانشطار، السكيراء pombe (س. pombe) هو نظام نموذجي درس جيدا أن كشفت بكل وضوح كبير في الأحداث الأولية في السيتوبلازمي. ومع ذلك، فإننا لا نفهم بوضوح كيف تختلف يتم تنسيق الأحداث cytokinetic spatiotemporally. لتحديد ذلك، يحتاج المرء إلى تحليل الأحداث cytokinetic مختلفة في تفاصيل كبيرة في كل من الزمان والمكان. نحن هنا وصف نهج المجهر لدراسة إف cytokinetic مختلفةالوالدان في الخلايا الحية. مع هذا النهج فمن الممكن لآخر الأحداث cytokinetic المختلفة، وتحديد وقت التوظيف للبروتينات مختلفة خلال الانقسام السيتوبلازمي. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف بروتوكولات لمقارنة توطين البروتين، والتوزيع في موقع انقسام الخلية. هذا هو بروتوكول الأساسي لدراسة الانقسام السيتوبلازمي في الخميرة الانشطار، ويمكن أن تستخدم أيضا لالخمائر الأخرى والنظم الفطرية.
Introduction
السيتوبلازمي، فإن الخطوة النهائية في انقسام الخلايا، وهو ضروري عملية معقدة للتمايز السليم، والتنمية، والبقاء على قيد الحياة للكائن الحي. ويشمل السيتوبلازمي الأحداث المتعددة التي يتم تنظيمها لضمان فصل الخلية ناجحة مع الحفاظ على سلامة الجينوم 1. ويشمل السيتوبلازمي الأحداث حيث حلقة أكتوميوزين تجميعها مرة واحدة يخضع انقباض، وهو بالتزامن مع توسع الغشاء وسرابات، وخارج الخلية الخلوية إعادة عرض المصفوفة، ثم أخيرا من قبل خلية اقتطاع 1، 2، 3. منظمة غير لائق من الأحداث cytokinetic يمكن أن يؤدي إلى عيوب فصل الخلية والصيغة الصبغية، ويمكن أن تسبب أمراض مثل السرطان 4، 5، 6، 7، 8. المبادئ الأساسية التي تمكن سبأنهم يعتمدون على الأحداث cytokinetic ليست مفهومة جيدا، مما يؤدي إلى حواجز الطرق في فهمنا لمسببات هذه الأمراض.
وpombe السكيراء الانشطار الخميرة (س. pombe) هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الانقسام السيتوبلازمي نظرا لطبيعة الحفظ من البروتينات المشاركة 1. في الخميرة الانشطار، بعد أكتوميوزين التجمع عصابة، عصابة يدخل نضوج / المرحلة يسكن حيث لا يحد 9. نضوج ينتهي مع بدء انقباض حلقة أكتوميوزين، المتزامنة مع سرابات الغشاء وingression الحاجز. أعطت العمل المنوي على مدى السنوات لنا فهم جيد إلى حد ما من أكتوميوزين التجمع حلقة في الانشطار الخميرة 1 و 9 و 10. ، هو التجمع الناجح للحلقة أكتوميوزين في بعض حقيقيات النوى، بما في ذلك الخميرة الانشطار لا يكفي لسرابات الغشاء. في وission الخميرة، حلقة انقباض وحدها لا توفر ما يكفي من القوة للتغلب على ضغط الامتلاء الداخلي لتشكيل ثلم 11. ويشير نموذج مؤخرا أن هذه القوة بدلا المقدمة من الحاجز ingression 11. في نموذج آخر، وقد اقترح دور تمديد غشاء البلازما للمساهمة في ثلم تشكيل 12 و 13. لا يحدث انقباض حلقة وسرابات الغشاء في درجة حرارة Bgs1 / Cps1 cps1-191 متحولة حساسة، الانزيم الرئيسي لتشكيل الحاجز الأساسي 14 و 15. خلايا تفتقر Bgs1 تظهر الحاجز الأساسي معيب ولفترات طويلة انقباض حلقة 15 و 16. يتم تجنيده Bgs1 إلى الموقع انقسام الخلايا لingression الحاجز أثناء النضج بعد أكتوميوزين عصابة التجمع 17 و 18. Similarlذ، خلال cellularization في أجنة ذبابة الفاكهة، حلقة انقباض هو ثنائي الطور مع بطيئة بشكل ملحوظ معدل انقباض الأولي 19، تشبه مرحلة النضج التي لوحظت في الخميرة الانشطار. قد تبطئ ثنائي الطور حلقة انقباض أسفل الغشاء سرابات للسماح كافية توسع غشاء 20 وتعديل المصفوفة خارج الخلية. وهذا يشير إلى أنه بعد أكتوميوزين التجمع عصابة، يحدث انقباض حلقة بكفاءة إلا عندما الخلية قد استوفت متطلبات تشكيل ثلم. ليست مفهومة جيدا ما هي الشروط اللازمة لانقباض حلقة أكتوميوزين بعد التجميع حلقة، ولا الأحداث الجزيئية التي تنظم هذه العملية. لقد أظهرنا مؤخرا أنه في أعقاب حلقة أكتوميوزين التجمع GTPase Cdc42 صغيرة تخضع لعملية فريدة من نوعها الزمانية المكانية نمط تفعيل 21. تم تأسيس هذا النمط من نمط التعريب فريد من Cdc42 العوامل الصرف غوانيدين النوكليوتيدات (GEFs) التي تنشط Cdc42. وGef1 مرفق البيئة العالمية يموضع إلى الحلبة أكتوميوزين تجميعها ويعزز بداية انقباض حلقة وingression الحاجز، بينما يموضع Scd1 إلى غشاء تثليم ويعزز تشكيل حاجز طبيعي. نجد أن نمط تفعيل Cdc42 التي وضعتها GEFs التي تؤدي إلى تنظيم الأحداث cytokinetic متميزة.
لفهم الآلية الجزيئية من الأحداث التي تؤدي في نهاية المطاف إلى فصل الخلية التالية التجمع حلقة أكتوميوزين، ويحتاج المرء لمتابعة الأحداث cytokinetic متميزة في الزمان والمكان. في الخميرة الانشطار، السيتوبلازمي تتضمن أولا تجميع العقد السلائف حول النواة، التي تجند في نهاية المطاف ميوسين من النوع الثاني، وformin Cdc12، وغيرها من البروتينات اللازمة لتجميع حلقة أكتوميوزين. لآخر الأحداث cytokinetic متميزة وتوفير إطار مرجعي، ويعتبر الفصل بين علامات الجسم القطب المغزل (تكوين المغزل) وقتها 0 22. تجميع عشريمكن اتباعها ه حلقة أكتوميوزين من خلال رصد مرور الوقت شدة الموسومة fluorescently أكتوميوزين البروتين حلقة مثل النوع الثاني الميوسين سلسلة ضوء التنظيمي Rlc1. نحن هنا وصف نهج المجهري لتحليل مختلف مراحل الانقسام السيتوبلازمي مع مرور الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفناها بروتوكول لدراسة الأحداث cytokinetic في الخميرة الانشطار بطريقة الزمنية. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر القرار الزماني للأحداث cytokinetic مختلفة مع الإشارة إلى بعضها البعض. توقيت التوظيف البروتين أو الخسارة مع الإشارة إلى مرحلة cytokinetic. هيكل حلقة طوال المراحل المختلفة…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).
Materials
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
Riferimenti
- Pollard, T. D. Mechanics of cytokinesis in eukaryotes. Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetica. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F. Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p. Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).
- . . Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochimica. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
