분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석
Summary
분열 효모는, 분열의 pombe는 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템, 세포 분열의 마지막 단계입니다. 여기에서 우리는 라이브 분열 효모 세포에서 다른 cytokinetic 이벤트를 분석하기 위해 현미경 방법을 설명합니다.
Abstract
세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 게놈 무결성을 유지하기 위해 중요합니다. 적절한 세포질 분열은 세포 분화 및 개발을위한 중요합니다. 세포질 분열이 아니라 시간과 공간에서 조정되는 일련의 사건을 포함한다. 세포질 분열 링 수축 멤브레인 고랑 형성 및 세포 외 기질 재 형성 하였다 분할 부위에서 액토 마이 오신 고리의 형성을 포함한다. 분열 효모,, 분열의 pombe (S.의 pombe)는 상당한 명확성과 세포질 분열의 초기 이벤트를 공개했다 잘 공부 모델 시스템입니다. 그러나, 우리는 cytokinetic 이벤트가 시공간으로 조정된다 명확 얼마나 다른지 이해하지 않습니다. 이를 확인하기 위해, 하나는 모두 시간과 공간에 훌륭한 세부에있는 다른 cytokinetic 이벤트를 분석 할 필요가있다. 여기에서 우리는 다른 cytokinetic EV를 조사하기 위해 현미경 접근 방식을 설명살아있는 세포에서 행군. 이 방법으로 다른 cytokinetic 이벤트 시간과 세포질 분열 동안 다른 단백질을 채용하는 시간을 결정하는 것이 가능하다. 또한, 우리는 세포 분열의 부위에서 단백질 지역화 및 분포를 비교하는 프로토콜을 기술한다. 이 분열 효모 세포질 분열을 연구하는 기본 프로토콜 및 다른 효모 및 곰팡이 시스템에 사용될 수있다.
Introduction
세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 유기체의 적절한 분화, 발달과 생존에 대한 복소 공정 필수적이다. 세포질 분열는 게놈 무결성 1을 유지하면서 성공적인 세포 분리를 보장하기 위해 조직 된 여러 이벤트를 포함한다. 세포질 분열 한번 조립 액토 마이 오신 링 마침내 세포 이탈 1, 2, 3,이어서 막 팽창 furrowing 및 세포 외 기질 재 형성, 동시 인 수축을 거쳐 이벤트를 포함한다. cytokinetic 이벤트 부적절한 조직 세포 분리 및 배수성 결함으로 이어질 수 있으며, 암 4, 5, 6, 7, 8과 같은 질환을 유발할 수있다. 활성화 기본 원리 오cytokinetic 이벤트 rganization 잘 따라서 이러한 질병의 원인에 대한 우리의 이해에 장애물로 이어지는 이해되지 않습니다.
분열 효모, 분열의 pombe (S.의 pombe)이 때문에 1 관련 단백질의 보존 된 자연 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 분열 효모에서, 링 어셈블리를 액토 마이 오신 후, 링은 9 수축하지 않는 성숙 / 드웰 단계로 들어갑니다. 성숙은 막 furrowing 및 격벽 ingression와 동시 액토 마이 오신 링 수축의 시작과 끝납니다. 지난 몇 년 동안 독창적 인 작품은 분열 효모 1, 9, 10, 우리에게 액토 마이 오신 링 어셈블리의 상당히 좋은 이해를 주었다. 분열 효모 등 일부 진핵 생물에서의 액토 마이 오신 링을 성공적으로 조립 막 furrowing 충분하지 않습니다. F에서ission 효모는, 링 수축 혼자 고랑 형성 (11) 내부 팽압을 극복하기에 충분한 힘을 제공하지 않습니다. 최근 모델이 힘 대신 격벽 ingression (11)에 의해 제공되는 것을 나타냅니다. 다른 모델에있어서, 세포막 연장 부의 역할을 형성 (12, 13)를 밭고랑에 기여 제안되었다. 반지의 수축과 막 furrowing는 Bgs1 / CPS1 온도에 민감한 돌연변이 cps1-191, 주 격벽 형성 (14), (15)의 주요 효소 발생하지 않습니다. Bgs1 부족한 세포에 결함이 주 격벽 및 연장 링 수축 (15, 16)을 보여줍니다. Bgs1은 링 어셈블리 (17), (18) 액토 마이 오신 후 성숙 중에 격벽 ingression 대한 세포 분열 사이트에 채용된다. SimilarlY는 초파리 배아에서 cellularization 동안, 링 수축은 분열 효모에서 관찰 된 성숙 단계를 닮은 상당히 느린 초기 수축 속도 (19)과 이상성입니다. 바이 페이 링 수축이 충분 막 확장 (20)과 세포 외 기질의 수정을 허용하는 막 furrowing 느려질 수 있습니다. 이것은 링 조립체 액토 마이 오신 후에, 링이 수축 셀 고랑 형성을위한 요구 사항을 만족할 효율적 때만 발생하는 것을 의미한다. 잘 액토 마이 오신 링 링 조립 한 후 수축 없으며,이 과정을 조절하는 분자 이벤트에 필요한 어떤 조건 이해되지 않습니다. 우리는 최근 액토 마이 오신 링을 다음을 조립 소는 GTPase Cdc42 고유 시공간 활성화 패턴 (21)을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 패턴은 Cdc42 구아니딘 뉴클레오타이드 교환 인자의 고유 파악 패턴 (기준 확립Cdc42을 활성화 GEFs). 지구 환경 기금 (GEF) Gef1는 조립 액토 마이 오신 링에 지역화 및 Scd1가 furrowing 막에 지역화 정상 격벽 형성을 촉진하면서, 링 수축 및 격벽 ingression의 발병을 촉진한다. 우리는 그 GEFs에 의해 설립 된 Cdc42 활성화 패턴이 독특한 cytokinetic 이벤트의 규제로 이어질 것을 찾을 수 있습니다.
결국 액토 마이 오신 링 조립체 다음 세포 분리가 발생할 이벤트의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 하나의 시간과 공간의 고유 cytokinetic 이벤트를 수행 할 필요가있다. 분열 효모에서 세포질 분열 먼저 결국 유형 II 미오신의 formin Cdc12 및 액토 마이 오신 링 조립에 필요한 다른 단백질을 모집 핵 주위 전구체 노드의 어셈블리를 포함한다. 시간으로 구별 cytokinetic 이벤트 및 참조 프레임을 제공는 스핀들 극 몸 마커 (스핀들 형성)의 분리는 시간 0 (22)로 간주됩니다. 일의 조립전자 액토 마이 오신 링은 형광 태그 액토 마이 오신 링 단백질의 강도와 같은 타입 II 규제 미오신 경쇄 Rlc1 시간이 지남에 모니터링 하였다 될 수있다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 세포질 분열의 다른 단계를 분석하는 미시적 접근 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 시간적인 방식으로 분열 효모에서 cytokinetic 이벤트를 연구하기 위해 프로토콜을 설명했다. 여기에 설명 된 프로토콜은 서로 다른 참조 cytokinetic 이벤트의 시간 해상도를 제공한다; 단백질 모집 또는 cytokinetic 위상을 참조하여 손실의 타이밍; 세포질 분열의 여러 단계에 걸쳐 반지의 구조; 유사 분열을 참조하여 세포질 분열의 진행. 이 프로토콜로 정확히 cytokinetic하여 다른 단계에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).
Materials
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
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