Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Summary

A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese, a fase final na divisão celular. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para analisar diferentes eventos cytokinetic em células de levedura de fissão ao vivo.

Abstract

A citocinese, o passo final na divisão celular é crítica para a manutenção da integridade do genoma. cytokinesis adequada é importante para a diferenciação celular e desenvolvimento. A citocinese envolve uma série de eventos que são bem coordenados no tempo e no espaço. A citocinese envolve a formação de um anel de actomiosina no local de divisão, seguido de constrição do anel, a formação de sulco de membrana e remodelação da matriz extracelular. A levedura de fissão, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um sistema modelo bem estudado que revelou com clareza substancial dos eventos iniciais em citocinese. No entanto, nós não entendemos claramente como diferentes eventos cytokinetic são coordenadas espaço-temporalmente. Para determinar isso, é preciso analisar os diferentes eventos cytokinetic em grandes detalhes no tempo e no espaço. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscopia para examinar diferentes ev cytokineticentos em células vivas. Com esta abordagem, é possível de tempo diferentes eventos cytokinetic e determinar o tempo de recrutamento de proteínas diferentes durante a citocinese. Além disso, descreve-se os protocolos para comparar localização de proteínas, e de distribuição no local de divisão celular. Este é um protocolo básico para estudar citocinese na levedura de fissão e também pode ser utilizado para outras leveduras e sistemas de fungos.

Introduction

A citocinese, o passo final na divisão celular, é essencial um processo complexo para a diferenciação adequada, o desenvolvimento e sobrevivência de um organismo. Citocinese envolve vários eventos que são organizados para garantir a separação de células com sucesso, mantendo a integridade genômica ^1. A citocinese envolve eventos em que um anel de actomiosina, depois de montado sofre constrição, que é simultâneo com a expansão da membrana e estrias, e remodelação da matriz celular extracelular, finalmente seguido por abscisão célula ^{1, 2, 3.} Organização indevido de eventos cytokinetic pode levar a defeitos de separação de células e de ploidia, e pode causar doenças como câncer ^{4, 5, 6, 7, 8.} Os princípios fundamentais que permitem SRGANIZAÇÃO de eventos cytokinetic não são bem compreendidos, conduzindo assim a bloqueios na nossa compreensão da etiologia destas doenças.

A levedura Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) é um excelente sistema modelo para estudar a citocinese devido à natureza conservada das proteínas envolvidas ^1. Em levedura, após actomiosina conjunto do anel, o anel entra em uma fase de maturação / pausa onde não contraem ^9. Maturação termina com o início da constrição do anel actomiosina, concomitante com franzindo a membrana e ingresso septo. Trabalho seminal ao longo dos anos deram-nos uma boa compreensão do conjunto do anel actomiosina na fissão de levedura ^{1, 9, 10.} Em alguns eucariotas, incluindo levedura de fissão, a montagem bem-sucedida do anel actomiosina não é suficiente para franzir membrana. na flevedura issão, anel de constrição por si só não fornece força suficiente para superar a pressão de turgescência interna para a formação do sulco ^11. Um modelo recente indica que esta força é, em vez fornecido pelo septo ingresso ^11. Noutro modelo, o papel da extensão da membrana de plasma tem sido sugerido para contribuir para a formação de sulco ^{12, 13.} Constrição do anel e franzindo a membrana não ocorrem na temperatura Bgs1 / CPS1 cps1-191 mutante sensível, a principal enzima para a formação do septo primário ^{14, 15.} Células sem Bgs1 mostrar septo primário defeituoso e prolongada constrição do anel ^{15, 16.} Bgs1 é recrutado para o site da divisão celular para ingresso septo durante a maturação após actomiosina conjunto do anel ^{17, 18.} Similarly, durante celularização em embriões de Drosophila, anel de constrição é bifásica com um significativamente lenta taxa de constrição inicial ^19, assemelhando-se a fase de maturação observada em levedura. Constrição anel bifásica pode abrandar franzindo a membrana para permitir a expansão suficiente membrana ²⁰ e a modificação da matriz extracelular. Isto sugere que, após actomiosina conjunto de anel, anel de constrição ocorre de forma eficiente apenas quando a célula tenha satisfeito os requisitos para a formação de sulco. Não está bem compreendido que as condições são necessárias para a constrição do anel actomiosina após a montagem do anel, nem os eventos moleculares que regulam este processo. Temos demonstrado recentemente que, após anel actomiosina montagem da pequena GTPase Cdc42 sofre um padrão de ativação espaço-temporal única ^21. Este padrão é estabelecido pelo padrão de localização única dos factores de troca de nucleótidos de guanidina CDC42 (GEFs) que activam Cdc42. O GEF Gef1 localiza ao anel actomiosina montado e promove aparecimento da constrição do anel e ingresso de septo, enquanto SCD1 localiza na membrana franzindo e promove a formação normal septo. Nós achamos que o padrão de ativação Cdc42 estabelecida por seus GEFs levar à regulamentação de eventos cytokinetic distintas.

Para entender o mecanismo molecular de eventos que, eventualmente, levar à separação de células após a montagem do anel de actomiosina, é preciso seguir os eventos cytokinetic distintas no tempo e no espaço. Em levedura, citocinese envolve primeiro o conjunto de nós precursoras ao redor do núcleo, que acabou por recrutar a miosina tipo II, o formin Cdc12 e outras proteínas necessárias para a montagem do anel actomiosina. Para tempo os eventos cytokinetic distintas e fornecem um quadro de referência, a separação de marcadores de corpos polares de fusos (formação do fuso) é considerado como tempo de 0 ^22. A montagem do the actomiosina anel pode ser seguida por monitorização ao longo do tempo a intensidade de uma proteína de anel de actomiosina fluorescente etiquetado, tais como o tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1. Aqui nós descrevemos uma abordagem microscópica para analisar diferentes estágios de citocinese ao longo do tempo.

Protocol

1. Preparação da Amostra Cultivar células de levedura de fissão que expressam o marcador fuso pólo corpo Sad1-mCherry 23 e tipo de cadeia leve reguladora da miosina II Rlc1-Tomate 24 em meios líquidos YE a 32 ° C durante 8 gerações. NOTA: Para mutantes sensíveis à temperatura, crescer as células a 25 ° C. Cultivar células à fase mid-log a uma DO600 de 0,5 em YE. Para saber mais sobre a fissão condições de crescimento de levedu…

Representative Results

Células de levedura que expressam o marcador de anel, Rlc1-GFP (verde, Figura 2) e o fuso marcador de corpos polares de Sad1-mCherry (vermelho, Figura 2) foram fotografadas durante citocinese. O início de marcador de corpos polares de fusos (seta branca, as Figuras 2A, B) é considerada como o tempo 0. sinal Rlc1-GFP aparece no momento -4 min com referência à separação de corpos polares de fuso (seta vermelha, as Figuras 2A, 2B). S…

Discussion

Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar eventos cytokinetic em levedura de fissão de uma forma temporal. O protocolo aqui descrito fornece resolução temporal de diferentes eventos cytokinetic com referência um ao outro; calendário de recrutamento de proteínas ou perda com referência à fase de cytokinetic; estrutura do anel ao longo das diferentes fases de citocinese; e a progressão da citocinese com referência a mitose. Com este protocolo, é possível definir com precisão a fase cytokinetic que podem…

Materials

Yeast extract media	Sunrise Science Products	YES 225	0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine
Agarose	SeaKem LE agarose, Lonza	50001
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Glass Bottomed culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.
VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system	Visitech International, UK		with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).
ImageJ	NIH		Image analysis software