Fisyon Maya Cytokinetic Olayların zamanmekansal Analizi
Summary
Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemi, hücre bölünmesi son aşamasıdır. Burada canlı fisyon maya hücreleri farklı cytokinetic olayları analiz etmek için bir mikroskop yaklaşım açıklar.
Abstract
Sitokinler, hücre bölünmesi son aşama genom bütünlüğünü korumak için önemlidir. Uygun sitokinez hücre farklılaşması ve gelişimi için önemlidir. Sitokinez iyi zaman ve mekan içinde koordine edilmiş bir dizi etkinlik gerektirir. Sitokinez halka daralmasının, membran karık oluşumu ve hücre dışı matriks yeniden izledi bölünme yerinde bir actomyosin halkasının oluşumunu kapsar. Fisyon maya, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) önemli bir açıklıkla sitokinez ilk olaylar ortaya koymuştur iyi çalışılmış bir model sistemidir. Ancak, biz cytokinetic olaylar spatiotemporally koordine açıkça nasıl farklı anlamıyorum. Bunu belirlemek için, bir hem zaman ve uzayda büyük ayrıntılarda farklı cytokinetic olayları analiz gerekiyor. Burada farklı cytokinetic EV incelemek için bir mikroskop yaklaşımı tanımlamakCanlı hücrelerdeki hastalar. Bu yaklaşımla farklı cytokinetic olayları zaman ve sitokinez sırasında farklı proteinlerin işe zamanını belirlemek mümkündür. Buna ek olarak, hücre bölünmesinin yerinde protein lokalizasyonu ve dağıtım karşılaştırma protokolleri açıklanmıştır. Bu füzyon mayada sitokinezi çalışma için temel bir protokoldür ve diğer maya ve mantar sistemleri için de kullanılabilir.
Introduction
Sitokinez, hücre bölünmesi son adımı, bir organizmanın uygun farklılaşması, geliştirme ve hayatta kalmak için karmaşık bir süreçtir esastır. Sitokinez genomik bütünlüğünü 1 korurken başarılı hücre ayrımı sağlamak için düzenlenen birden fazla etkinlik içerir. Sitokinez kez oluşturulan bir aktomiyosin halkası son olarak hücreyi absisyon 1, 2, 3, ardından membran genişleme ve yarıklar, ve hücre dışı matriks yeniden modellenmesi ile eş zamanlı bir daralma, maruz etkinlikleri kapsar. Cytokinetic olayların yanlış organizasyon hücre ayırma ve Ploidi kusurlarına yol açabilir ve kanser 4, 5, 6, 7, 8 gibi hastalıklara neden olabilir. etkinleştirmek temel ilkeler ocytokinetic olayların rganization iyi böylece bu hastalıkların etiyolojisinde anlayışımız içinde barikatlar yol anlaşılamamıştır.
Yank mayası Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) nedeniyle 1 ilgili proteinlerin korunmuş doğası sitokinezi incelemek için mükemmel bir model sistemidir. Fizyon maya, halka düzeneğini actomyosin sonra, halka bu 9 sıkmak olmayan bir olgunlaşma / bekleme aşamaya girer. Olgunlaşma membran furrowing ve septum Ingression'a ile eş zamanlı actomyosin halka daralmasının, başlaması ile sona erer. Yılda seminal iş fisyon maya 1, 9, 10, bize actomyosin halka montaj oldukça iyi bir anlayış verdik. füzyon maya da dahil olmak üzere, bazı ökaryotlarda ise, aktomiyosin halkasının başarılı bir montaj membran yarıklar için yeterli değildir. fission maya halka daralması, tek başına veya ark oluşumu 11 iç turgor basıncının üstesinden gelmek için yeterli bir kuvvet sağlamamaktadır. Son zamanlarda modeli bu kuvvet yerine septum Ingression'a 11 tarafından sağlanır belirtir. Başka bir modelde, plazma membranı uzantısı rolü oluşumu 12, 13 karık katkıda önerilmiştir. Halka konstriksiyon ve membran yarıklar Bgs1 / CPS1 ısıya duyarlı bir mutant cps1-191 primer septum oluşumu 14, 15 için büyük bir enzim meydana gelmez. Bgs1 eksik Hücreler arızalı birincil septum ve uzun süreli halka daralma 15, 16 göstermektedir. Bgs1 halka takımını 17, 18 actomyosin sonra olgunlaşma sırasında septum Ingression'a için hücre bölünmesi sitesine işe alınır. Similarly Drosophila embriyolar Hücreselleştirmeden sırasında, halka daralma fisyon maya gözlenen olgunlaşma evresini benzeyen bir ölçüde yavaş başlangıç daralma oranı 19 ile bifazik olduğunu. Bifazik halka daralma yeterli membran genişleme 20 ve hücre dışı matris modifikasyonu için izin vermek için membran furrowing yavaşlatabilir. Bu halka düzeneğini actomyosin sonra, halka daralma hücre karık oluşumu için gereksinimleri tatmin etti verimli yalnızca oluşur düşündürmektedir. İyi actomyosin halka halka montaj sonrası daralma, ne de bu süreci düzenleyen moleküler olaylar için gerekli olan hangi koşullar anlaşılamamıştır. Biz son zamanlarda actomyosin halka aşağıdaki montaj küçük GTPaz Cdc42 eşsiz uzaysal aktivasyon deseni 21 uğradığını göstermiştir. Bu model Cdc42 guanidin nükleotid değişimi faktörlerin benzersiz yerelleştirme deseni (tarafından kurulmuşturCdc42 aktive gefs). GEF Gef1 monte aktomiyosin halkasına lokalize ve SCD1 furrowing membrana lokalize ve normal septum oluşumu teşvik ederken, halka daralmasının ve septum Ingression'a başlamasını teşvik eder. Biz onun gefs tarafından kurulan Cdc42 aktivasyon deseni farklı cytokinetic olayların düzenlenmesinde yol açtığını bulmak.
Sonunda actomyosin halka montaj aşağıdaki hücre ayrılmasına neden olayların moleküler mekanizmasını anlamak için, bir zaman ve mekan içinde farklı cytokinetic olayları takip etmek gerekiyor. fizyon maya, sitokinez ilk sonunda tip II miyozinin, formin Cdc12 ve actomyosin halka montaj için gerekli olan diğer proteinleri işe çekirdeğin etrafında habercisi düğümleri, montajını kapsamaktadır. Zaman farklı cytokinetic olaylar ve referans çerçevesi sağlamak, iğ kutup vücut belirteçleri (iğ oluşumu) ayrılması zaman 0 22 olarak kabul edilir. th montajıe aktomiyosin halkasının bir floresan etiketli aktomiyosin halkası protein yoğunluğu tip II miyosin regülatör hafif zincir Rlc1 zamanla izlenmesi ile takip edilebilir. Burada zamanla sitokinez farklı aşamalarını analiz etmek için bir mikroskopik yaklaşım açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada bir zamansal bir şekilde fisyon maya cytokinetic olayları incelemek için bir protokol tanımlanmıştır. Burada açıklanan protokol birbirine göre farklı cytokinetic olayların zamansal çözünürlüğü sağlar; Protein alımı veya cytokinetic faza referansla kaybı zamanlaması; sitokinez farklı aşamalarında halkanın yapısı; ve mitoz referansla sitokinez ilerlemesi. Bu protokol sayesinde hassas ve böylece farklı cytokinetic aşamalarında yer proteinlerin daha ayrıntılı bir anlayış sağlay…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).
Materials
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
Riferimenti
- Pollard, T. D. Mechanics of cytokinesis in eukaryotes. Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Genetica. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F. Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p. Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).
- . . Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochimica. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
