Analys av Cap-bindande proteiner i mänskliga celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
Translationell kontroll framstår som en lika viktigt steg för transkriptionsreglering i genuttryck, särskilt under perioder av cellulär stress 1. En brännpunkt översättnings kontroll är det hastighetsbegränsande steget om inledande där de första stegen i proteinsyntesen involverar bindning av den eukaryota inledande faktorn 4E (eIF4E) till 7-metylguanosin (m 7 GTP) 5 'cap av mRNA 2 . eIF4E är en del av en trimer komplex som heter eIF4F som innehåller eIF4A, en RNA-helikas och eIF4G, en byggnadsställning protein som erfordras för att rekrytera andra faktorer översättnings och 40S ribosom 3. Under normala fysiologiska betingelser, är den stora majoriteten av mRNA översätts via en cap-beroende mekanism, men under perioder av cellulär stress approximativt 10% av humana mRNA-sekvenser innehåller 5 'UTR som kan ge cap-oberoende translation intiation 1,4. Cap-beroende översättning har historiskt varit synonymdigt med eIF4F dock stressspecifika variationer av eIF4F har blivit en trend ämne 5-8.
Olika cellulära påfrestningar orsakar eIF4E aktivitet undertryckas via mammalian target of rapamycin komplex 1 (mTORC1). Detta kinas blir nedsatt under stress, vilket resulterar i ökad aktivitet av ett av sina mål, det 4E bindande protein (4E-BP). Icke-fosforylerad 4E-BP binder till eIF4E och blockerar dess förmåga att interagera med eIF4G orsakar repression av locket beroende översättning 9,10. Interestingly, en homolog av eIF4E namnges eIF4E2 (eller 4EHP) har en mycket lägre affinitet för 4E-BP 11, kanske gör det möjligt att kringgå stressen-medierad repression. I själva verket, till en början karaktäriseras som en repressor av översättning på grund av sin bristande samverkan med eIF4G 12, eIF4E2 initierar översättning av hundratals mRNA som innehåller RNA hypoxi svarselement i deras 3 'UTR under hypoxisk stressen 6,13. Denna aktivering is som uppnås genom interaktioner med eIF4G3, RNA-bindande proteinmotiv 4, och hypoxi inducerbara faktorn (HIF) 2α för att utgöra en hypoxisk eIF4F komplexa eller eIF4F H 6,13. Som en repressor under normala förhållanden, eIF4E2 binder med GIGYF2 och ZNF598 14. Dessa komplex, delvis identifieras genom agaros-länkade m 7 GTP affinitetshartser. Denna klassiska metoden 15 är standard inom översättning och är den bästa och mest använda tekniken för att isolera cap-bindande komplex i pull down och in vitro bindningsanalyser 16-19. Då locket beroende translation maskiner framstår som flexibel och anpassningsbar med inter förändrande delarna 6-8,13, är denna metod ett kraftfullt verktyg för att snabbt identifiera nya cap-bindande proteiner som är involverade i stressvaret. Vidare variationer i eIF4F kan få stora återverkningar som flera eukaryota modellsystem verkar använda en eIF4E2 homolog för stressreaktioner sådanasom A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, och C. elegans 23.
Uppgifter tyder på att variationer i eIF4F inte kan vara strikt begränsad till betona villkor, men att delta i normal fysiologi 24. Syretillförseln till vävnader (vid kapillära ändar) eller inom vävnader (mätt via mikroelektroder) varierar från 2-6% i hjärnan 25, 3-12% i lungorna 26, 3,5-6% i tarmen 27, 4% i levern 28, 7-12% i njuren 29, 4% i muskel 30, och 6-7% i benmärgen 31. Celler och mitokondrier innehåller mindre än 1,3% syre 32. Dessa värden är mycket närmare hypoxi än den omgivande luften, där cellerna är rutinmässigt. Detta tyder på att det som tidigare betraktades som hypoxi specifika cellulära processer kan vara relevant i en fysiologisk miljö. Intressant nog eIF4F och eIF4F H </sup> aktivt delta i översättnings initiering av olika pooler eller klasser av mRNA i flera olika humana cellinjer som utsätts för fysiologisk syre eller "physioxia" 24. Låg syrehalt driver också korrekt fosterutveckling 33 och celler har generellt högre spridningshastigheter, längre livslängd, mindre DNA-skador och mindre allmän stressreaktioner i physioxia 34. Därför är eIF4F H sannolikt en viktig faktor i uttrycket av utvalda gener under fysiologiska förhållanden.
Här ger vi ett protokoll för att odla celler i fasta fysiologiska syreförhållanden eller i ett dynamiskt varierande område som är sannolikt mer representativ för vävnadsmikromiljöer. En fördel med denna metod är att cellerna lyseras inuti hypoxi arbetsstation. Det är inte ofta klart hur övergången från hypoxiska cellkultur till cellys utförs i andra protokoll. Celler ofta avlägsnas först från en liten hypoxi inkubator varaförgrunden lys, men denna exponering för syre kan påverka biokemiska vägar som den cellulära responsen för syre är snabb (en eller två min) 35. Vissa cap-bindande proteiner kräva interaktion med en andra bas eller kan hydrolysera m 7 GTP, därför några cap Interactmedlemmar kan missas i reningsprocessen. Agaros-kopplade till enzymatiskt resistenta cap-analoger kan vara substituerad i detta protokoll. Utforska verksamhet och sammansättning eIF4F H och andra varianter av eIF4F genom den metod som beskrivs här kommer att kasta ljus över de intrikata genuttryck maskinerier som celler använder under fysiologiska förhållanden eller stressreaktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analysen av cap-bindande proteiner i humana celler som utsätts för fysiologiska syreförhållanden kan medge identifiering av nya syrereglerade translationsinitierings- faktorer. Affiniteten av dessa faktorer för 5 'cap av mRNA eller andra cap associerade proteiner kan mätas genom styrkan av deras associering till m 7 GTP bunden agaros-pärlor. En varning med denna teknik är att den mäter locket bindande potential av proteiner post-lys, men den utförs under icke-denaturerande förhållanden som beh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
Riferimenti
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).
- Weingarten-Gabbay, S., et al. Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes. Science. 351 (6270), (2016).
- Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biol. 16, 90 (2015).
- Ho, J. J., et al. Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus. Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).
- Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).
- Ho, J. J., Lee, S. A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes. Trends Biochem Sci. , (2016).
- Lin, T. A., et al. PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation. Science. 266 (5185), 653-656 (1994).
- Richter, J. D., Sonenberg, N. Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins. Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).
- Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1. FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).
- Rom, E., et al. Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).
- Uniacke, J., et al. An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery. Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).
- Morita, M., et al. A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development. Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).
- Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium. Biochimica. 23 (2), 177-181 (1984).
- Kiriakidou, M., et al. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation. Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).
- Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex. EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).
- Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export. J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).
- Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20. Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).
- Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana. J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).
- Ptushkina, M., et al. A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties. Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).
- Cho, P. F., et al. A new paradigm for translational control: inhibition via 5′-3′ mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP. Cell. 121 (3), 411-423 (2005).
- Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform. Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).
- Timpano, S., Uniacke, J. Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation. J Biol Chem. , (2016).
- Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes. Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).
- Le, Q. T., et al. An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).
- Muller, M., et al. Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery. Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).
- Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy. Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).
- Muller, M., et al. Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation. Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).
- Richardson, R. S., et al. Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability. J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).
- Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers. Blood. 99 (1), 394 (2002).
- Gleadle, J., Ratcliffe, P. . Hypoxia. , (2001).
- Gluckman, E., et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi’s anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).
- Parrinello, S., et al. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous. FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Newby, D., Marks, L., Lyall, F. Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls. Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).
- Pyronnet, S., et al. Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E. EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).
- Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP. Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).
- Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
- Gu, M., et al. Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity. Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).
- Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs–a new tool for the analysis of cap-binding proteins. RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).
- Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. Characterization of mammalian eIF4E-family members. Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).
