Här beskriver vi en metod för att ladda ett kalciumkänsligt färgämne genom fröens nervstubbe i nervändarna. Vi presenterar också ett protokoll för inspelning och analys av snabba kalciumtransienter i perifera nervändarna.
En av de mest genomförbara metoderna för mätning av presynaptiska kalciumnivåer i presynaptiska nervterminaler är optisk inspelning. Den baseras på användning av kalciumkänsliga fluorescerande färgämnen som förändrar deras utsläppsintensitet eller våglängd beroende på koncentrationen av fria kalcium i cellen. Det finns flera metoder som används för att fläcka celler med kalciumfärger. Mest vanliga är processerna för att ladda färgerna genom en mikropipett eller förinkubera med acetoximetylesterformerna av färgämnena. Dessa metoder är emellertid inte helt tillämpliga på neuromuskulära korsningar (NMJ) på grund av metodiska problem som uppstår. I den här artikeln presenterar vi en metod för att ladda ett kalciumkänsligt färgämne genom frönsnerven i groddarna i nervändarna. Eftersom inträde av yttre kalcium i nervterminalerna och den efterföljande bindningen till kalciumfärgen sker inom millisekundens tidsskala är det nödvändigt att använda ett snabbt bildningssystem för att registrera dessa interaktionerns. Här beskriver vi ett protokoll för registrering av kalciumtransienten med en snabb CCD-kamera.
Kalciumjoner (Ca 2+ ) deltar i många neuronal signaleringsprocesser, inklusive initiering, underhåll och plasticitet av mediatorfrisättning 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Vid ankomsten av åtgärdspotentialet går extracellulär Ca2 + in i nervterminalen och initierar frigöring av neurotransmittor. I vissa synapser kan kalciumströmmen mätas direkt med elektrofysiologiska metoder 6 , 7 , 8 . I fallet med den neuromuskulära korsningen (NMJ) kan man inte använda direkt patch-klämma och tvåelektrodspänningsklemmeteknik på grund av minutens storlek på nervändarna.
Inspelningar av inåtgående Ca 2+ strömmar från nervändarna i NMJ kan utföras med indirekta elektrofyserIologiska metoder 9 , 10 . Dessa metoder kräver emellertid förbehandling av synaps med natrium- och kaliumjonkanalblockerare. Optiska metoder kräver inte den farmakologiska separationen av jonströmmar i nervterminalen och möjliggör inspelningar av Ca2 + -strömmen, utlöses av åtgärdspotentialer och den efterföljande höjningen av Ca2 + -joner i axoplasmen 11 , 12 , 13 , 14 . Dessa metoder är baserade på inspelningar av förändringar i fluorescensen hos specifika Ca2 + -sensitiva färgämnen vid bindningen av fria Ca2 + -joner 15 , 16 , 17 , 18 , 19 .
Ca 2+ indikatorer kan laddas i cElls genom olika metoder, beroende på experimentets syfte. Forskare använder badapplikationen av membranpermeabla färgämnen 20 , 21 , laddning via patchpipett 22 eller mikroinjektion 23 , 24 , 25 . Alla dessa metoder har emellertid vissa begränsningar när det gäller NMJ på grund av dess särdrag i synaptisk arkitektonik. För NMJ är den mest praktiska och framgångsrika metoden att ladda färgämnet genom nervstubben, en framfyllningsmetod 26 , 27 , 28 , 29 . Denna teknik kan användas för att ladda olika fluorescensfärger i perifera nervändarna. Denna metod användes framgångsrikt för Drosophila nervterminaler 28 , ödemotornerven28 och grovmotorens nervterminaler 17 , 26 , 27 , 30 . Beroende på objektet som studeras kan metodiska detaljer variera. En glasmikro-pipett kan användas för små nerver från larverna 28 . Flera forskare har beskrivit en metod 27 , 28 där en nyskuren ände av nerv som inerverar en muskel är nedsänkt i en brunn som är förfylld med ett färgämne. Preparatet lämnas sedan i flera timmar för att suga färgämnet. Färgen blöts upp av axonerna och transporteras till nervterminalerna. I det här dokumentet beskriver vi en metod för att ladda en fluorescensindikator i frösmotorens nervterminaler genom nervstubben. Vårt protokoll använder ett plastpipettips för inkubation av vävnaden med ett färgämne. Vi beskriver också hur man förvärvar och analyserar Ca 2+ fluorescens transients.
I det här dokumentet presenterade vi metoden att utföra Ca 2+ -sensitiv färgning i fröens nervändar genom nervstubben. Vid slutet av laddningsproceduren har alla terminaler i den proximala delen av nerven signifikanta nivåer av fluorescens. Det har uppskattats att sondens intra-terminala koncentration varierar mellan 40 och 150 uM 17 .
Inkubationsproceduren utförs i två steg: vid rumstemperatur och sedan vid en lägre temperatur i kylskåp. Det är viktigt att kontrollera tiden för vävnadsinkubation med färgämnet vid rumstemperatur. Beroende på den faktiska längden på nervstubben kan det specifika färgämnet och temperaturen inkubationstiden variera. Om överexponerade kan terminaler i de proximala delarna nära nervstubben vara överbelastade. Men i mitten av delen är det fortfarande möjligt att hitta terminaler som är tillfredsställande laddade. Under thEn lång inkubation i kylskåp, färgen är jämnt fördelad över nervändarna.
Våra egna observationer 33 , 35 samt data från andra forskare 30 bevisar avsaknaden av något märkbart inflytande av laddningsförfarandet på amplituden för det postsynaptiska svaret eller på frekvensen för miniatyrändplattans potentialer. God livslängd dokumenterades i de laddade förberedelserna. Det finns några viktiga punkter som vi vill uppmärksamma. Det är väldigt viktigt att placera nervstubben i färgämne-laddningslösningen inåtgående minuter efter excision för att möjliggöra att färgämnet kommer in i axonen hos den skurna nerven; Förseningar kan orsaka ineffektiv laddning, förmodligen på grund av återföringen av nervaxonerna 27 , 36 . Några undersökare fördjupa nervstubben i 100 mM EDTA (en Ca 2 + – och Mg 2+ -kelator) Omedelbart efter excisionen av nerven för att förhindra att de skurna axonerna återförs. Bufferten avlägsnas efter 1-2 minuter och ersätts med en färgämneslösning 37 . Användningen av en petroleumgelbrunn i stället för plaströr för laddningsproceduren möjliggör användning av en kortare nervstubbe. Under användningen av detta tillvägagångssätt skärs nerven efter det att den nedsänktes i HEPES-lösningen med färgämne, och axonerna försluts inte på grund av bristen på divalenta joner i färglösningen 27 , 28 .
I vår studie använde vi den vattenlösliga saltformen av Ca 2+ -indikatorn istället för dextran. Dextrankonjugaten diffunderar i axonen långsammare än saltformerna. Användningen av dextran-konjugatet minskar emellertid färgkammarisering och hantering av nerven och NMJ. Kalciumgrönt 1-3 000 MW dextran-konjugat har en god diffusionshastighet och visar minskad avdelning <s Up class = "xref"> 38.
Det är mycket viktigt att undvika en lång period av fluorescerande belysning av vävnaden, eftersom det påverkar dess hälsa och överlevnad. Vi använder Nomarski optik i synlig ljuskanal för att söka efter nervterminaler. Under inspelningen begränsar vi det upplysta fältet med ett membran.
Det är anmärkningsvärt att denna laddningsmetod endast är lämplig för preparat som tål långa inkubationer. För att minska färgad laddningstid när studier utförs på mer bräckliga vävnader ( t.ex. synapser av varmblodiga djur), är det nödvändigt att nedskalera nervstubbanlängden och använda mikropipetter för att ladda 29 , 39 .
Denna laddningsteknik är väl lämpad för avbildningsändringar i cytosolisk Ca 2+ , med fluorescerande indikatorer under både enkel-nervstimulering och rytmisk synaptisk aktivitetEf "> 17 , 27 , 35. Analysen av Ca 2+ -transientamplituden kan användas för att studera påverkan av olika substanser på kalciumintaget som deltar i neurotransmittorfrisättning 33 .
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning utfördes under den ryska regeringens program för konkurrenskraftig tillväxt av Kazans federala universitet och ett bidrag från den ryska grunden för grundforskning (16-04-01051; 16-34-00817; 15-04-02983). Vi tackar fyra anonyma granskare för att ge användbara kommentarer om tidigare utkast till manuskriptet. Vi uttrycker vår tacksamhet till Yuliya Aratskaya för röstinspelningen. Vi är tacksamma för Dr Victor Ilyin för de många hjälpsamma kommentarerna och hjälpen med manuskriptets slutliga redigering.
Ca2+ indicator | Molecular Probes, USA | Oregon Green 488 BAPTA-1 hexapotassium salt, O6806 | 500 μg |
Silicone Elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 elastomer | |
Pipette | Biohit, Russia | 720210 | 0.5-10µL |
Pipette tip | Fisher Scientific, USA | 02-707-175 | 10µL |
Pipette tip | Biohit, Russia | 781349 | 10µL |
Razor Blade | Fisher Scientific, USA | 12-640 | |
Minutien Pins | Fine scince tools, Canada | 26002-20 | |
Corneal Mini-Scissors | MT MEDI CORP, Canada | S-1111 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9610 | |
Jeweler Forceps | MT MEDI CORP, Canada | F-9611 | |
Modelling clay | local producer | can be replaced by any local producer | |
Petroleum jelly | local producer | can be replaced by any local producer | |
Microspin FV 2400 | Biosan, Latva | BS-010201-AAA | |
Multi-spin MSC 3000 | Biosan, Latva | BS-010205-AAN | |
Single-use hypodermic needles | Bbraun | 100 Sterican | 0.4×40mm |
Syrynge | local producer | 0.5 ml | |
HEPES | Sigma-Aldrich, USA | H0887 | 100ml |
Microscope, BX51 | Olympus, Japan | ||
Stereomicroscope, Leica М80 | Leica Microsystems , Germany | ||
Illumination system Leica CLS 150Х | Leica Microsystems, Germany | ||
Data acquisition system | Molecular Devices, USA | Digitdata 1550 | |
software | Molecular Devices, USA | pClamp software, Version 10 | protocol can be download from : http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with. RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro |
Bath and bath temperature controler | Experimental Builder | can be replaced by any chamber with temperature control. For example from https://www.warneronline.com/ | |
Monochromator | Till Photonics, Germany | Polychrome V | no longer available, can be replaced by other sutable stable light source 488 nm |
monochromator control software | Till Photonics, Germany | Polycon | |
Digital CCD camera | Redshirt imaging, USA | Neuro CCD SMQ | |
Model 2100 Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems, USA | ||
Suction electrode | Kazakov, A. Prostoj vsasyvajushhij jelektrod dlja jelektricheskoj stimuljacii biologicheskih ob’ektov / M.Aleksandrov, N.V.Zhilyakov, E.F. Khaziev, D.V. Samigullin // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. – T. 40. – №9. – S. 13-16. | http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii- biologicheskix-obektov/ |
|
Acquisition software for CCD camera | Redshirt imaging, USA | Turbo SM software | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Spreadsheet program | Microsoft, USA | Microsoft Office Excel |