The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Mesenkymale stamceller / stromale celler (MSC) lover godt i bioteknologi og regenerativ medicin. MSC'er kan isoleres fra flere voksne væv via deres stærke tilslutning til vævsdyrkningsplastic og derefter yderligere ekspanderes in vitro, mest almindeligt ved hjælp af føtalt bovint serum (FBS). Da FBS kan forårsage MSC'er bliver immunogene, dets tilstedeværelse i MSC-kulturer begrænser både kliniske og eksperimentelle anvendelser af cellerne. Derfor beskæftiger undersøgelser kemisk definerede xeno-fri (XF) medier for MSC kulturer er yderst værdifuld. Mange gavnlige virkninger af MSC'er er blevet tilskrevet deres evne til at regulere inflammation og immunitet, hovedsagelig gennem sekretion af immunmodulerende faktorer såsom tumornekrosefaktor-stimuleret gen 6 (TSG6) og prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC kræver aktivering for at producere disse faktorer og da effekten af MSC er ofte forbigående, har stor interesse opstået for at finde måder af præ-aktivering cellerne prior deres anvendelse, og dermed fjerne latenstiden for aktivering in vivo. Her præsenterer vi protokoller til effektivt aktivere eller prime MSC i tre-dimensionelle (3D) kulturer under kemisk definerede XF forhold og til at administrere disse præ-aktiverede MSC'er in vivo. Konkret har vi først beskrive metoder til at generere sfæriske MSC mikro-væv eller "sphæroider« i hængende dråber bruger XF mellemstore og vise, hvordan de kugler og konditioneret medium (CM) kan høstes til forskellige applikationer. For det andet beskriver vi genekspression skærme og in vitro funktionelle assays til hurtigt at vurdere niveauet af MSC aktivering i sfæroider, understreger den antiinflammatoriske og anti-cancer potentiale af cellerne. Tredje beskriver vi en hidtil ukendt fremgangsmåde til at injicere intakte MSC sfæroider i musen peritoneale hulrum til in vivo-effektivitet test. Samlet set protokollerne heri overvinde store udfordringer for at opnå præ-aktiverede MSC'er under kemisk defineret XF conbetingelser og giver et fleksibelt system til at administrere MSC sfæroider for behandlinger.
Mesenkymale stamceller / stromaceller (MSC'er) har vist stort potentiale for forskellige regenerativ medicin tilgange. MSC'er blev indledningsvis isoleret som et stromal bestanddel af knoglemarv, men er siden blevet opnået fra talrige andre voksne væv, herunder fedtvæv 1, 2, 3. Interessant, den vigtigste isoleringsmetode omfavner den bemærkelsesværdige egenskab af MSC'er til at klæbe fast på vævskulturplast i nærværelse af føtalt bovint serum (FBS). Mens dette traditionelle isolation teknik tillader nem og hurtig ekspansion af MSC'er i todimensionale (2D) kultur, er det også meget kunstige og ignorerer betydningen af det native tredimensionale (3D) miljø, der fører til potentielle tab af vigtige cellulære karakteristika 4, 5 6. Derfor studiet af MSC'er i 3D-kulturer, somer mere fysiologisk end traditionelle 2D kulturer, er opstået i søgning efter "tabte / formindsket" MSC egenskaber. Endvidere har stor interesse steget til identificere xeno-fri (XF) kemisk definerede betingelser for MSC kultur og aktivering, og således gøre cellerne mere medgørlige til kliniske anvendelser.
Mange undersøgelser er blevet offentliggjort viser 3D-kultur af MSC'er både biomaterialer og som sfæriske aggregater eller sphæroider. MSC'er i biomaterialer blev oprindeligt udviklet til væv tekniske tiltag til at erstatte beskadigede væv med celle-seedede stilladser, mens kugleformede kulturer af MSC'er ses som en måde at forstå MSC adfærd in vivo efter administration af cellerne for behandlinger i prækliniske eller kliniske forsøg 4, 5, 7. Interessant, MSC danner sfæroider spontant, når tilslutning til vævskultur plast er ikke tilladt8, 9, 10. Traditionelt blev celle aggregering lettes ved spinner kolbe metoder eller flydende overlay teknikker, metoder oprindeligt anvendt i cancer biologi i bestræbelserne på at forsøge at efterligne tumor mikromiljø. For nylig er yderligere fremgangsmåder dukket at demonstrere celleaggregering i dyrkningsskåle præ-overtrukket med specifikke kemikalier for at forhindre celle-til-plast vedhæftning 4, 5, 6. En af de enkleste og mest økonomiske metoder til at generere MSC sfæroider er at kulturen dem i hængende dråber, en teknik, der ofte blev anvendt til fremstilling embryoide legemer fra embryonale stamceller. Med hængende dråbe dyrkningsteknik, er cellevedhæftning til vævsdyrkningsplastic forhindres ved at suspendere cellerne i en dråbe medium på undersiden af en vævskulturskål låg og tillader tyngdekraften til at lette celle AGGREGation i spidsen af dråben. Sfæroiden størrelse kan let manipuleres ved at ændre cellekoncentration eller drop volumen, hvilket gør hængende dråbe kulturer særlig let at kontrollere.
Tidlige undersøgelser af 3D kultur af MSC'er demonstrerede radikale forskelle i karakteristika for cellerne i 3D sammenlignet med deres 2D modstykker 6, 8, 9. Samtidig, rapporter vist, at de gavnlige virkninger af MSC'er in vivo påberåbes deres evne til at blive aktiveret af mikro-miljømæssige påvirkninger, og som svar, til at producere anti-inflammatoriske og immunmodulerende faktorer 11. Interessant, mange af disse faktorer, såsom prostaglandin E2 (PGE2), tumornekrosefaktor-stimuleret gen 6 (TSG6), og hepatocytvækstfaktor (HGF) blev produceret i meget større mængder af MSC sfæroider end traditionelle 2D MSC'er baner vejen for den ide omved hjælp af 3D-kulturer for at aktivere cellerne 8, 12, 13. Desuden genaktivering i 3D-kulturer syntes at rekapitulere mekanismer, i det mindste delvist, af celleaktivering efter injektion i mus 12. Ved at aktivere MSC'er forud for deres anvendelse i eksperimenter, kan virkningerne af cellerne blive forlænget og mere fremtrædende som den traditionelle MSC effekt in vivo ofte er forsinket og forbigående, og kan beskrives som "hit og køre". I løbet af de sidste mange år har vigtige funktionelle undersøgelser under anvendelse af MSC sfæroider vist, at de kan undertrykke inflammatoriske responser og modulerer immunitet in vivo ved at påvirke effektorceller såsom makrofager, dendritiske celler, neutrofiler, og T-celler gør sfæroider en attraktiv form for primede MSC'er 2 3. Desuden produktion af anti-cancer molekyler, såsom interleukin-24 (IL-24) og tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL), forhøjes i 3D kulturer af MSC'er i forhold til monolag MSC'er, et fænomen, der kan udnyttes til målrettede behandlinger mod kræft 8, 10, 14.
Som den traditionelle MSC kultur ikke blot krævede anvendelse af vævskultur plast, men også FBS, til en anden hurdle gøre MSC sfæroider mere medgørlige til klinisk anvendelse skulle overvindes. For at løse dette hurdle, vi for nylig viste dannelse af MSC spheroids under specifikke kemisk definerede XF forhold og konstateret, at de resulterende MSC sfæroiderne blev aktiveret til at producere de samme anti-inflammatoriske og anti-cancer molekyler som sfæroiderne genereret i forhold med FBS 14. Her er disse resultater præsenteres i flere detaljerede protokoller, der viser dannelsen af præ-aktiverede MSC'er i 3D kulturer bruger XFmedier. Desuden er protokoller præsenteret som beskriver effektive måder til at vurdere aktivering niveauer af MSC'erne i forhold til deres anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-cancer effekt, sammen med en praktisk metode til at levere de intakte sfæroider i mus.
Den optimale MSC til brug i nogle forskning og kliniske anvendelser bør være meget aktiveres for at maksimere deres fordel, og fortrinsvis udarbejdet under kemisk definerede XF betingelser for at minimere levering af potentielle antigener fra xenogene mellemstore komponenter såsom FBS. I de protokoller, der er beskrevet her, har vi vist metoder til 1) aktivere MSC'er i 3D kultur ved dannelse af sfæroider, 2) opnå 3D-aktivering af MSC under XF betingelser, 3) vurdere aktivering niveauer af kugleformede MSC i for…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
(-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |