Производство и введения терапевтических мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (MSC) Spheroids грунтованный в 3-D культур Под Зенона свободных условиях
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), весьма перспективны в биоинженерии и регенеративной медицины. MSCs может быть выделен из нескольких взрослых тканей с помощью их сильной присоединения к тканевой культуры , пластика , а затем дополнительно расширен в лабораторных условиях , наиболее часто с использованием фетальной бычьей сыворотки (FBS). Поскольку ФБС может вызвать MSCs стать иммуногенными, его присутствие в MSC культур ограничивает как клинические и экспериментальные применения клеток. Таким образом, исследования с использованием определенного химического Зенона бесплатно (XF) среды для MSC культур являются чрезвычайно ценными. Многие полезные эффекты ПКЦ, были отнесены к их способности регулировать воспаление и иммунитет, главным образом, за счет секреции иммуномодулирующих факторов, таких как фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и простагландин Е2 (ПГЕ2). Тем не менее, MSCs требует активации, чтобы произвести эти факторы и так как действие MSCs часто преходящи, большой интерес возник, чтобы обнаружить способы предварительной активации клеток PrioR для их использования, таким образом , исключая время задержки для активации в естественных условиях. Здесь мы представляем протоколы для эффективного включения или простых MSCs в трехмерных (3D) культур при химически определенных условиях и XF управлять этими предварительно активированная MSCs в естественных условиях. В частности, мы сначала опишем методы для создания сферической MSC микро-ткани или «сфероидов» в висячей капли с использованием среды и XF демонстрируют, как сферы и кондиционированной среды (CM) могут быть собраны для различных областей применения. Во- вторых, мы опишем экраны экспрессии генов и в пробирке функциональные тесты для быстрой оценки уровня активации MSC в сфероидов, подчеркивая противовоспалительное и противораковое потенциал клеток. В- третьих, мы опишем метод романа впрыснуть неповрежденные MSC сфероидов в брюшную полость мыши для естественных условиях тестирования эффективности в. В целом, протоколы в данном документе преодолеть основные проблемы получения предварительно активированного MSCs под химически определенной XF Conвиям и обеспечивают гибкую систему для администрирования MSC сфероиды для лечения.
Introduction
Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), показали большой потенциал для различных регенеративных подходов медицины. МСК были первоначально выделены в виде стромального компонента костного мозга , но с тех пор были получены от многих других тканях взрослого организма, в том числе жировой ткани 1, 2, 3. Интересно отметить, что основной способ изоляции включает замечательное свойство ПКЦ, чтобы плотно прилипать на тканевой культуры, пластика в присутствии эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Хотя этот традиционный метод выделения позволяет легко и быстрое расширение MSCs в двумерной (2D) культуры, это также очень искусственным и не принимает во внимание значение нативной трехмерной (3D) окружающей среды , ведущие к потенциальной потере важных клеточных характеристик 4, 5 , 6. Таким образом, изучение MSCs в 3D культур, которыйявляются более физиологичным, чем традиционные 2D культур, возникла в поисках «потерянных / заниженных" MSC характеристик. Кроме того, большой интерес поднялся, чтобы идентифицировать Xeno свободных (XF) химически определенные условия для MSC культуры и активации, и таким образом сделать клетки более податливыми для клинического применения.
Многие исследования были опубликованы демонстрации 3D культуры ПКЦ как в биоматериалов и в виде сферических агрегатов или сфероидов. MSCs в биоматериалов первоначально были разработаны для тканевой инженерии подходы для замены поврежденных тканей с сотовыми посеяны каркасах, в то время как сфероида культуры MSCs рассматривались как способ понять поведение MSC в естественных условиях после введения клеток для терапии в доклинических или клинических испытаний 4, 5, 7. Интересно, что MSCs форма сфероидов спонтанно, когда присоединение к культуре ткани пластика не допускается8, 9, 10. Традиционно агрегация клеток облегчается с помощью методов колбах центрифужных или жидких методов наложения, методы, используемые первоначально в биологии рака в усилиях, чтобы попытаться имитировать микроокружение опухоли. В последнее время , дополнительные методы всплыли , которые демонстрируют агрегацию клеток в культуральные чашки , предварительно покрытые конкретными химическими веществами , чтобы предотвратить клетки к пластический адгезии 4, 5, 6. Один из самых простых и экономичных методов для генерации MSC сфероидов к культуре их в висячей капли, метод, который часто используется для получения эмбриональных телец из эмбриональных стволовых клеток. С свисающими технику культуры, прилипание клеток к культуре ткани пластика предотвращается путем суспендирования клеток в капле среды на нижней стороне ткани культуры блюдо крышкой и позволяя тяжести, чтобы облегчить клеточную AGGREGвания в вершине капли. Размер сфероид можно легко манипулировать с помощью изменения концентрации клеток или объема капли, что делает свисающими культур особенно легко контролировать.
В ранних исследованиях на 3D культуры ПКЦ продемонстрировали радикальные различия в характеристиках клеток в 3D по сравнению с их аналогами 2D 6, 8, 9. В то же время, отчеты показали , что благотворное воздействие MSCs в естественных условиях полагались на их способности активируются с помощью микро-сигналы окружающей среды и, в ответ, чтобы произвести противовоспалительное и иммуномодулирующее факторы 11. Интересно отметить, что многие из этих факторов, таких как простагландин Е2 (PGE2), фактор некроза опухоли-стимулированной гена 6 (TSG6) и фактор роста гепатоцитов (HGF) были произведены в гораздо больших количествах MSC сфероидов, чем традиционные 2D MSCs прокладывают путь для Идеяс использованием 3D культур , чтобы активировать клетки 8, 12, 13. Кроме того, активация генов в 3D культурах появились перепросматривать механизмы, по крайней мере частично, активации клеток после инъекции в мышей 12. При активации MSCs до их использования в экспериментах эффекты клеток может быть продлен и более заметным , как традиционный MSC эффект в естественных условиях часто задерживается и переходных процессов , и может быть описана как "хит и запустить". В течение последних нескольких лет, важные функциональные исследования с использованием MSC сфероиды, показали , что они могут подавлять воспалительные реакции и модулирования иммунитета в естественных условиях, оказывая влияние на эффекторные клетки , такие как макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и Т – клеток , что делает сфероидов привлекательной формой загрунтованных ПКЦ ; 2 , 3. Кроме того, производство молекул противораковых, таких как Interleukin-24 (ИЛ-24) и фактор некроза опухолей , связанных с апоптозиндуцирующая лиганд (TRAIL), увеличены в 3D культурах ПКЦ по отношению к монослойный MSCs, явление , которое может быть использовано для целенаправленной терапии рака 8, 10, 14.
В соответствии с требованием не только использование тканевой культуры пластика, но и FBS традиционная культура MSC, еще одно препятствие, чтобы сделать MSC сфероиды более пригодным для клинического применения было необходимо преодолеть. Для решения этого препятствия, мы недавно показали образование MSC сфероидов при определенных химически определенных условиях и XF установлено , что в результате MSC сфероиды были активированы для получения тех же молекул противовоспалительными и противораковыми как сфероидов , генерируемых в условиях с FBS 14. Здесь эти результаты представлены в нескольких детальных протоколов, которые демонстрируют генерацию предварительно активированных MSCs в 3D культур с использованием XFСМИ. Кроме того, протоколы представлены, которые описывают эффективные способы оценки уровней активация MSCs в отношении их противовоспалительными, иммуномодулирующими и противораковым действием, вместе с практическим способом доставить неповрежденные сфероидов в мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимальная MSC для использования в некоторых научно-исследовательских и клинических применений должны быть высоко активированы, чтобы максимизировать их выгоду, и предпочтительно получают в химически определенных условиях XF, чтобы минимизировать доставку потенциальных антигенов и?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
Riferimenti
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
- Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
- Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
- Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
- Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
- Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
- Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
- Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).
