La PCR bloccante di tipo selvatico seguita dal sequenziamento diretto offre un metodo di rilevamento altamente sensibile per le mutazioni somatiche a bassa frequenza in una varietà di tipi di campioni.
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Articolo metodologico
Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche
In questo articolo
Sommario
Abstract
rilevazione accurata identificazione di mutazioni a bassa frequenza possono essere problematico nel valutare malattia residua dopo la terapia, screening per mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia, o quando i pazienti hanno poche cellule tumorali circolanti. Wild-type blocco PCR seguita da analisi di sequenziamento offre alta sensibilità, flessibilità e semplicità come una metodologia per individuare queste mutazioni a bassa frequenza. Con l'aggiunta di un costume disegnato bloccato oligonucleotide acido nucleico ad una nuova o precedentemente stabilito saggio di sequenziamento PCR convenzionale, sensibilità di circa 1 allele mutante in un fondo di 1.000 alleli WT possono essere raggiunti (1: 1.000). artefatti sequenziamento associati ad eventi deaminazione trovano comunemente nei tessuti paraffina fissate in formalina può essere parzialmente ovviato dall'utilizzo di uracile glicosilasi DNA durante fasi di estrazione. Il protocollo ottimizzato qui è specifico per la rilevazione MYD88 mutazione, ma può servire come modello per la progettazione di qualsiasisaggio di WTB-PCR. Vantaggi del test WTB-PCR su altri saggi comunemente utilizzati per la rivelazione di mutazioni a bassa frequenza incluse allele specifico PCR e real-time PCR quantitativa comprendono meno occorrenze di falsi positivi, una maggiore flessibilità e facilità di implementazione, e la capacità di rilevare sia noto e mutazioni sconosciute.
Introduzione
Sanger sequenziamento è stato tradizionalmente il gold standard in fase di test per entrambi noti e sconosciuti mutazioni somatiche. Uno dei limiti di sequenziamento Sanger è il suo limite di rilevabilità (~ 10 - 20% allele mutante in un contesto di WT) 1. Questo livello di sensibilità è appropriato per rivelare mutazioni somatiche basso livello che possono essere presenti nei campioni di tessuti precancerose o pazienti con poche cellule tumorali circolanti, o quando midollo osseo (BM) è irregolare. Questo rende anche valutare malattia residua dopo la terapia o la rilevazione di mutazioni di resistenza emergenti durante la terapia difficile me....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: Tutti i test di campioni umani è stata eseguita dopo aver ottenuto l'approvazione Institutional Review Board (IRB).
1. Estrazione del DNA da FFPE tessuto, sangue periferico, e aspirato midollare
- Per midollo osseo tessuto FFPE con kit di estrazione del DNA FFPE
- Iniziare con FFPE tessuto dai vetrini non colorati (5 - 10 sezioni: 5 - 10 um di spessore).
NOTA: Se inizio con trucioli di tessuto, usare 3 - 6 sezioni a 5 - 10 micron di spessore e passare al punto 1.1.6. - Posizionare i vetrini in un cestino scivolo e preparare quattro serbatoi di lavaggio (due per xilene e due per il 10....
- Iniziare con FFPE tessuto dai vetrini non colorati (5 - 10 sezioni: 5 - 10 um di spessore).
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Risultati
Una panoramica concettuale di WTB-PCR durante l'estensione è presentato in Figura 1. Poiché un singolo nucleotide disadattamento nell'ibrido bloccante-DNA diminuisce notevolmente la sua temperatura di fusione (AT m = 20 - 30 ° C), amplificazione dell'allele WT è bloccato mentre DNA stampo mutante è libero di completare l'estensione 17. In questo modo, il DNA mutante è amplificato esponenzialmente mentre WT DNA viene ampl.......
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Discussione
Il saggio WTB-PCR qui descritto utilizza una serie generica di primer con un oligo blocco progettato per bloccare l'amplificazione di DNA WT durante l'estensione (Figura 1). Il prodotto di WTB-PCR viene quindi sequenziato per l'analisi mutazionale. L'utilità di WTB-PCR / Sanger risiede nella sua semplicità, ad alta sensibilità e alta produttività. Utilizzando le indicazioni descritte qui, la maggior parte dei saggi basati Sanger esistenti possono essere facilmente modificati tramite l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock da 1,5 o 2 ml | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcol | VWR | 89370-084 | Grado istologico; 91,5% etanolo, 5% alcol isopropilico, 4,5% alcol metilico |
| 3730XL sequenziatore | ABI | o equivalente | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Per la purificazione PCR a biglie magnetiche |
| Alluminio lamine sigillanti | GeneMate | T-2451-1 | Per PCR e celle frigorifere |
| BigDye Terminator v3.1 Kit di sequenziamento del ciclo | Life Technologies | 4337455 | Per il sequenziamento bidirezionale. Con centrifuga tampone per sequenziamento |
| 5804 Series | Rotore Eppendorf | A-2-DWP (per piastra PCR) | |
| Piastra fredda per piastre a 96 pozzetti | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, acqua | |||
| dNTP (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Magnete con gonna laterale | Thermo Fisher Scientific | 12027 | Per l'uso nella purificazione PCR. |
| Etanolo Assoluto | Sigma | E7023 | 200 proof, per biologia molecolare |
| Sito web Exiqon Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polimerasi (5 U/µ L) | Roche | 12032937001 | Con tampone di reazione PCR concentrato 10x, con 20 mM di MgCl2 |
| Gel elettroforesi | agarosio al 2% | ||
| Kit di estrazione FFPE GeneRead DNA | Qiagen | 180134 | Contiene uracile DNA glicosilasi necessaria per ridurre gli artefatti di sequenziamento |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | Per il sequenziamento. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = basi LNA) |
| M13-F Primer di sequenziamento | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Primer di sequenziamento | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuga Modello 5430 | Rotore Eppendorf | FA-45-30-11 (per provette per microcentrifuga da 1,5/2 mL) | |
| Spettrofotometro NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific PCR | ||
| primer diretto | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TT GAT GGR | |
| PCR REVERSE PRIMER | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR piastre | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettatori | 20, 200, 1.000 & micro; L | ||
| Setti per piastre, 96 pozzetti | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Per aspirato BM e sangue periferico |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | Per analisi di sequenziamento |
| Cestello | |||
| Acetato di sodio (3 M, pH 5,2) | Sigma | S7899 | |
| per pipette sterili con filtro | 20, 200, 1.000 & micro; L | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Serbatoio | ~ 1.000 mL | ||
| Xilene | VWR | 89370-088 | Grado istologico |
Riferimenti
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M.
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Ristampe e permessi
