Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
Hassas algılama ve düşük frekanslı mutasyon tanımlama tedavisi sırasında direnç mutasyonları ortaya için tarama, tedavi sonrasında kalan hastalık değerlendirilirken sorunlu olabilir, ya da hastaların birkaç dolaşımdaki tümör hücrelerinin olduğunda. dizi analizi, ardından PCR bloke Yabani tip, bu düşük frekans mutasyonları tespit etmek için bir yöntem olarak, yüksek hassasiyet, esneklik ve kolaylık sunar. tespit edilmiş bir yeni veya daha önce geleneksel PCR bazlı sıralama deneyi için nükleik asit oligonükleotid kilitli özel tasarlanmış ekleyerek, 1000 WT alel kökenli, yaklaşık 1 mutant allelin duyarlılıkları (: 1000 1) elde edilebilir. deaminasyon olaylarla ilişkili Ardışık eserler yaygın kısmen ekstraksiyon adımları sırasında urasil DNA glikosilaz kullanımı ile giderilebilir formalinde tespit edilmiş parafine gömülmüş dokularda bulunan. Optimize edilmiş protokol burada MyD88 mutasyonu tespit etmek için özeldir, ancak herhangi tasarlamak için bir şablon olarak hizmet verebilirWTB-PCR deneyi. PCR, gerçek zamanlı kantitatif PCR yanlış pozitiflerin az oluşumları, daha büyük esneklik ve uygulama kolaylığı, özel allel de dahil olmak üzere düşük frekanslı mutasyonların saptanması için yaygın olarak kullanılan deneylerde fazla WTB-PCR yöntemi avantajları, ve her ikisi de bilinen tespit yeteneği ve bilinmeyen mutasyonlar.
Introduction
Sanger sıralama geleneksel olarak bilinen ve bilinmeyen somatik mutasyonları için test altın standart olmuştur. Sanger sekanslama sınırlamaların bir algılama onun sınırı (~ 10 – WT bir arka içinde% 20, mutant alel) 1. hassasiyet düzeyi, birkaç dolaşımdaki tümör hücreleri veya kemik iliği (BM) düzensiz olduğu zaman ile premalign dokular ya da hastalardan alınan örneklerde bulunabilen düşük seviyede somatik mutasyonları tespit etmek için uygun değildir. Bu aynı zamanda, tedavi sonrası kalan hastalık teşhisinde ya da tek başına, 2, geleneksel dizileme ile zor tedavi sırasında gelişen direnç mutasyonları tespit yapar. Kilitli nükleik asit (LNA) geleneksel PCR değiştirerek Sanger dizileme PCR'yi (WTB-PCR) ile bloke vahşi tip aracılı, WT bir arka planda% 0.1 mutant allelin hassasiyetleri 2, 3, 4 elde edilebilir. İçindeWT DNA WT DNA, bir avantaj olarak amplifikasyonuna tercihli olarak bağlanan – (14 NT ~ 10) bloke edilmesi (LNA) oligonükleotid WTB-PCR, mutant alelleri için zenginleştirme kısa eklenmesi ile elde edilir. Mutant zenginleştirilmiş WTB-PCR ürünü daha sonra sıralanabilir. WT DNA engelleme yerine belirli mutasyonların seçilerek WTB-PCR, dakikada hücre fraksiyonlarında mevcut bilinen ve bilinmeyen mutasyonlar zenginleştirilmesi için izin verir.
Çeşitli yöntemler halen küçük hücre fraksiyonlarında mutasyonları tespit etmek için kullanılır. Bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (DHPLC), taneler, emülsiyonlar, amplifikasyon ve manyetizma (ışık saçan), elektrik alan ile indüklenen serbest bırakılması ve ölçüm (EFIRM) denatüre allel spesifik PCR amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS), yüksek çözünürlük içerir erime noktası ve diğerleri. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu yanlış pozitiflerin ve sadece deney 4 için tasarlanmış bir mutasyon tespit etme yeteneğine sınırlıdır </> Sup. WTB-PCR, bununla birlikte, çok sayıda mutasyon tipleri tespit edilmesini sağlar ve eserler veya deaminasyon olaylar nedeniyle yanlış pozitif dışlanması yardımcı olabilir dizileme izleri görselleştirmek için olanak sağlar. Yeni dizileme (NGS) konvansiyonel sekanslama için uygun bir alternatif sunmaktadır, bununla birlikte, önemli ölçüde daha yüksek maliyetler, karmaşıklık ve daha uzun deney süresi o birkaç farklı moleküler işaretlerle birçok hastalık tipleri için ya da ortaya çıkan için tedavisi gören hastaların izlenmesi için gereksiz bir seçenek sunmak direnç mutasyonları. % 5'den daha düşük mutant alel frekansları ile Ayrıca, yüksek yanlış pozitif oranlar tespit varyantlar 6, amplikon bazlı NGS 5 için bir problem teşkil edebilir.
Burada Albitar ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi miyeloid farklılaşma faktörü 88 geninde mutasyon taranmasında WTB-PCR ile elde edilen duyarlılık artışı göstermektedir. 3 MyD88 mutations Waldenstrom Makroglobulinemı (WM) bilinmeyen önemi (IgM-MGUS'u) arasında, IgM monoklonal gammapati, dalak marjinal zon lenfoma (SMZL) önemli tanısal ve prognostik faktörlerdir ve büyük B hücreli lenfoma (DBBHL) dağınık. MyD88 mutasyonları WM hemen hemen tüm vakalarda ve İmmünoglobulin M (IgM) MGUS salgılayan olan hastaların yaklaşık% 50'sinde bulunur. Çelişkili, MyD88 mutasyonlar SMZL hastaların sadece% 0-6 bulunan ve çok merkezli miyelom 7, 8 mevcut olmayan. Üst üste binen morfolojik, immünofenotipik sitogenetik ve WM ve SMZL ya da çoğu zaman diferansiyel teşhisleri karmaşık IgM, multipl miyelom ile klinik özellikleri nedeniyle, bir MyD88 mutasyonun varlığı faydalı bir tanımlama faktör 9 olarak hizmet edebilir. MyD88 mutasyonlar, tedavi 7 Aşağıdaki DLBCL ve kötü genel sağkalımla hastalarda daha fazla hastalık yükü ile ilişkilidir </sup> 10. Ayrıca, MyD88 mutasyonları daha sık aktive B hücreli benzeri (ABC) DBBHL bulunur çünkü B-hücresi benzeri (GCB) DBBHL veya primer mediastinal B hücreli lenfoma (PMBL), MyD88 mutasyon durumu olarak hizmet edebilir germinal merkez ABC alt tipi 11, 12, surrogate markın.
burada sağlanan detaylı bir protokol, yeni analizler geliştirilebilir ya da Varolan dizilim deneyleri kolayca doğru çeşitli örnek tipler, düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için adapte edilebilir bir şablon olarak hizmet vermektedir. yaklaşım izleme ve tümör veya hasta hedefli bir tedavi ya da antibiyotikler ile tedavi ediliyor ise gelişebilir bakterilerde bile gelişebilir dirençli mutasyonları tespit etmek için kullanılabilmektedir. Ayrıca, adresleri ve özellikle formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokusu içinde, mutasyon zenginleştirme ile ilişkili sorunların çoğu ilaçlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen WTB-PCR deneyi uzatma (Şekil 1) sırasında WT DNA'nın amplifikasyonunu engellemek üzere tasarlanmış bir bloke etme oligo primerler genel bir kümesini kullanır. WTB-PCR ürünü daha sonra mutasyon analizi için sekanslanır. WTB-PCR / Sanger yardımcı sadeliği, yüksek hassasiyet ve yüksek verimli olarak bulunur. Burada tarif edilen kurallara kullanılarak, çoğu mevcut Sanger bazlı deneyler sadece büyük ölçüde hassasiyeti artırmak için bir bloke edici oligon?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
Riferimenti
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
