שחזור בקנה מידה גדול ועצמאי, Clustering משוחדת בהתבסס על מדדי מורפולוגי לסווג נוירונים באוכלוסיות סלקטיבי
Summary
פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית, שכותרתו בעקבות זיהום מדרדר עם וירוס כלבת מהונדס להביע סמני ניאון, ואשכול עצמאי, ללא דעות מוקדמות מנתח המאפשר אפיון מקיף של מדדים מורפולוגיים בין subclasses העצבית ברורה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר שחזורים בקנה מידה גדולה של נוירונים בשילוב עם השימוש של אשכולות עצמאיים ואובייקטיביים מנתח ליצור סקר מקיף של מאפייני מורפולוגיים נצפו בקרב אוכלוסייה עצבית סלקטיבית. שילוב של טכניקות אלה מהווה גישה חדשנית לאיסוף וניתוח של נתונים neuroanatomical. יחד, טכניקות אלו מאפשרות בקנה מידה גדולה, ולכן יותר מקיפה, דגימה של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית ולהקים שיטות כמותיות משוחדות לתיאור כיתות עצביות ייחודיות מורפולוגית בתוך אוכלוסייה.
הפרוטוקול מתאר את השימוש וירוס הכלבת מהונדסים לתייג נוירונים באופן סלקטיבי. G-deleted מעשי וירוס כלבת כמו נותב מדרדר לאחר הזרקת stereotaxic לתוך מבנה מוח היעד של ריבית משמש ככלי עבור המשלוח והביטוי של EGFP בנוירונים. מספר רב של נוירונים נגועים באמצעות זהטכניקה ולהביע GFP לאורך הדנדריטים שלהם, בהפקת "Golgi דמוי" ממלא מלאה של נוירונים בודדים. לפיכך, שיטת העקיבה מדרדרת הווירוס בתיווך משפרת עם טכניקות איתור מדרדר מבוסס צבען מסורתי על ידי ייצור ממלא תאיים מלא.
נוירונים בודדים מבודדים היטב פורשים בכל האזורים לאזור המוח נחקר נבחרים לשיקום על מנת לקבל מדגם מייצג של נוירונים. הפרוטוקול מתאר נהלים לשחזר גופי תא ולהשלים דפוסי arborization הדנדריטים של נוירונים שכותרתו פורשים סעיפי רקמות מרובים. נתונים מורפולוגי, כולל משרות של כל נוירון בתוך מבנה המוח, המחולצים לניתוח נוסף. פונקציות תכנות תקן נוצלו כדי לבצע אשכול עצמאי ניתוחים והערכות אשכול המבוססות על מדדים מורפולוגיים. כדי לאמת את השירות של ניתוחים אלו, הערכות סטטיסטיות של perfo ניתוח אשכולותrmed על 160 נוירונים משוחזרים בגרעין רשתי התלמוס של התלמוס (הטורנירים) של קוף מקוק נעשה. הן ניתוח האשכול המקורי ואת ההערכות הסטטיסטיות בצעו כאן עולים כי נוירונים הטורנירים מופרדים לשלוש תת-אוכלוסיות, כל אחד עם מאפייני מורפולוגיים ייחודיים.
Introduction
הנוירואנטומיה הוא אחד היסודות של מדעי המוח 1 וריבית האחרונה "connectomics" חדש התלהבות להבנת המגוון מורפולוגיים של אוכלוסיות נוירונים ואת הקשרים בין הנוירונים ספציפיים 2. שיטות תיוג ונוירונים בשחזור השתפרו מאוד עם החידושים האחרונים, כולל מעקב במעגל גנטיים וירוס בתיווך גישות 3, 4, מה שמאפשר סקרים מורפולוגיים מקיפה יותר של אוכלוסיות נוירונים 5. בנוסף לשיפורי תיוג נוירונים בודדים, טכניקות ניתוח נתונים כמותיים גם התבררו כי יש לאפשר סיווג עצמאי ובלתי משוחד של נוירונים לתוך תת-אוכלוסיות נבדלות זה מזה המבוססים על נתונים מורפולוגיים 5, 6. טכניקות בלתי משוחדות אלה מהוות שיפור על יותר traditional שיטות סיווג איכותיים להיות הסטנדרט בתחום במשך יותר ממאה שנה. מטרת מחקר זה היא לתאר, צעד אחר צעד, את השילוב של תיוג בתיווך וירוס של נוירונים בתוך אוכלוסייה סלקטיבית, שחזורים בקנה מידה גדולה של מדגם מקיף של הנוירונים האלה, וניתוח נתונים כמותיים על בסיס אשכולות עצמאיים עם הערכות סטטיסטיות. על ידי שילוב של שיטות אלה, אנו המתאר גישה חדשנית כלפי לאיסוף והניתוח של נתוני neuroanatomical כדי להקל דגימה מקיפה וסיווג משוחד של סוגי נוירונים ייחודיים מורפולוגית בתוך אוכלוסייה עצבית סלקטיבית.
כדוגמא אחת מהשיטות הללו, אנו מתארים את הניתוח שלנו של אוכלוסייה גדולה של נוירונים בתוך מגזר אחד של גרעין רשתי התלמוס (הטורנירים) של קוף מקוק. נתונים אלו הם ממחקר לפני 7. שיטות תיוג סלקטיבי נוירונים טורנירים מקרינים על גב lateraגרעין l ברך של התלמוס (dLGN) באמצעות הזרקה כירורגית של וירוס כלבת שונה קידוד 4 EGFP, 8 (ראה טבלה של חומרים / ציוד ספציפי, שורה 2) מפורטים. נגיף הכלבת שונה זה חסר את הגן המקודד חלבון מעיל חיוני, ביטול התנועה טרנס-סינפטיים של הנגיף. לאחר הנגיף נכנס מסוף האקסון באזור הזריקה, הוא מתנהג כמו נותב מסורתי מדרדר עם היתרון החשוב של נהיגת ביטוי EGFP ברחבי arborization הדנדריטים המלא של נוירונים נגועים 5, 9, 10. בהתאם לכך, נגיף כלבת G-deleted זה יכול להיות מנוצל כדי להדביק באופן סלקטיבי לתייג כל אוכלוסייה עצבית לאחר הזרקה ותחבורה מדרדרת.
על מנת לבצע ניתוח מקיף של אוכלוסייה עצבית ספציפית, חשוב לדגוםבעל פיזור גדול של נוירונים בתוך האוכלוסייה. בגלל הטכניקה תיוג בתיווך וירוס מייצרת תאיים שלם, "Golgi דמוי" ממלא של נוירונים רבים עם אקסונים באזור הזריקה וירוס, אפשר לשחזר מדגם גדול מאוד של נוירונים בתוך מלוא היקף מבנה המוח. בנוסף, מאחר וירוס הכלבת השונה כל כך יעיל מדביק ולמתג מספר גדול של נוירונים, אפשר לשחזר מאה נוירונים לכל בעלי חיים. נהלי דגימת 160 נוירונים בכל המגזר החזותי של הטורנירים 11 על מנת לייצר מדגם מקיף של נוירונים טורנירי dLGN-מקרין מתוארים. התהליך של שחזור נוירונים בודדים באמצעות מערכת שיקום נוירון כולל מיקרוסקופ, מצלמה, ותוכנות שחזור מתואר. כמו כן תאר שיטות כדי לקבוע עמדות של נוירונים בודדים בתוך מבנה מוח (במקרה זה בתוך הטורנירים) וכדי לאמת לשבת הזרקת וירוסנפח דואר ומיקום בתוך מבנה (במקרה זה בתוך dLGN) באמצעות שחזורים מתאר נפח. צעדים לייצא נתונים מורפולוגיים ולבצע אשכול עצמאית וניתוחים המבוססים על מדדים מורפולוגיים נמדד עבור כל נוירון מתוארים. ישנן מגבלות על שיטות אשכולות ויש גם מגוון של אלגוריתמים באשכולות שונים זמין. בהתאם לכך, אפשרויות אלה ואת היתרונות של חלק האלגוריתמים יותר נפוצים מתוארות. מניתוח האשכולות אינו מספק אימות סטטיסטית הייחודיות של אשכולות. לכן, צעדים נוספים מתוארים לאמת אשכולות אופטימליים כמו גם את היחסים בין נתונים מורפולוגיים בתוך ועל פני אשכולות. שיטות סטטיסטיות להערכת אשכולות של בסיס נתוני הטורנירים כדי לאשר נוירונים טורנירים מקובצים שלושה אשכולות ייחודיים המבוססים על 10 מדדי מורפולוגיים עצמאיים מתוארות.
לכן, על ידי בהתוויית צעדי תיוג סלקטיביבתהליך שיקום, וניתוח נתונים מורפולוגיים מאוכלוסייה עצבית ספציפית, אנו מתארים שיטות לכימות הבדלים מורפולוגיים בין הנוירונים בתוך אוכלוסייה. ממצאים קודמים של סוגי נוירונים ברורים בתוך המגזר החזותי של טורנירי קוף מקוק הם אשרו עם שיטות הערכה סטטיסטיות נפרדות. ביחד, אנו מקווים הטכניקות הללו תהיינה חל רחב למערכות נתוני neuroanatomical ולעזור להקים סיווג כמותי של מגוון אוכלוסיות נוירונים דרך המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרי neuroanatomical נותרו עמוד הנוירולוגיה הריבית האחרונה connectomics ויחסי מבנה-תפקוד חדש התלהבות לאפיון מורפולוגי מפורט של אוכלוסיות נוירונים סלקטיבית. באופן מסורתי, מחקרי neuroanatomical יש לסמוך על סיווגים איכותיים של נוירונים למעמדות ברורות מורפולוגית של נוירונים שהוגדרו על ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות בני זוג. אד Callaway ומרוט Usrey עבור ומאפשר לנו להשתמש הרקמה המוכנה כחלק מחקר קודם ולבי Fairless ו Shiyuan ליו לעזרה עם שחזורים עצביים. עבודה זו מומנה על ידי NIH (ניי: EY018683) וקרן וייטהול.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
Riferimenti
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
