Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos
Summary
Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.
Abstract
Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de las neuronas en combinación con el uso de la agrupación independiente e imparcial análisis para crear un estudio exhaustivo de las características morfológicas observadas entre una población neuronal selectiva. La combinación de estas técnicas constituye un enfoque novedoso para la recogida y análisis de datos neuroanatómicos. En conjunto, estas técnicas permiten a gran escala, y por lo tanto más amplio, el muestreo de poblaciones neuronales selectivos y establecer métodos cuantitativos para describir imparciales clases neuronales morfológicamente únicos dentro de una población.
El protocolo se describe el uso de virus de la rabia modificado para etiquetar selectivamente las neuronas. G-elimina actos virus de la rabia como un trazador retrógrado tras la inyección estereotáxica en una estructura cerebral diana de interés y sirve como un vehículo para el suministro y la expresión de EGFP en las neuronas. Un gran número de neuronas están infectadas usando estetécnica y expresar GFP a través de sus dendritas, la producción de rellenos "Golgi" completos de las neuronas individuales. Por consiguiente, el método de rastreo retrógrado mediada por virus mejora sobre las técnicas tradicionales de rastreo retrógrado con base de tinte mediante la producción de rellenos intracelulares completas.
Individuales neuronas bien aisladas que abarcan todas las regiones de la zona del cerebro en estudio se seleccionan para la reconstrucción con el fin de obtener una muestra representativa de las neuronas. El protocolo describe los procedimientos para reconstruir los cuerpos celulares y completar los patrones de arborización dendrítica de neuronas marcadas que abarcan múltiples cortes de tejido. Los datos morfológicos, incluyendo posiciones de cada neurona dentro de la estructura del cerebro, se extraen para su posterior análisis. funciones de programación estándares se utilizaron para llevar a cabo agrupación independiente de análisis y evaluaciones de racimo basados en métricas morfológicas. Para comprobar la utilidad de estos análisis, la evaluación estadística de un análisis de conglomerados performado en 160 neuronas reconstruidas en el núcleo reticular del tálamo del tálamo (TRN) del macaco fue hecho. Tanto el análisis de conglomerados original y las evaluaciones estadísticas realizadas aquí indican que las neuronas TRN se dividen en tres subpoblaciones, cada una con características morfológicas únicas.
Introduction
Neuroanatomía es uno de los fundamentos de la neurociencia 1 y el interés reciente en "conectómica" ha renovado el entusiasmo para la comprensión de la diversidad morfológica de poblaciones neuronales y las conexiones entre las neuronas específicas 2. Los métodos para el etiquetado y la reconstrucción de las neuronas han mejorado en gran medida con las innovaciones recientes, incluyendo el trazado de circuito y genética mediada por virus enfoques 3, 4, lo que permite estudios morfológicos más amplios de poblaciones neuronales 5. Además de las mejoras en el etiquetado de las neuronas individuales, técnicas de análisis de datos cuantitativos también han surgido que permiten la clasificación independiente e imparcial de las neuronas en distintas subpoblaciones en base a los datos morfológicos 5, 6. Estas técnicas son imparciales una mejora sobre más TRADICIONAl métodos cualitativos de clasificación que han sido la norma en el campo durante más de un siglo. El objetivo de este estudio es describir, paso a paso, la combinación de etiquetado mediada por virus de las neuronas dentro de una población selectiva, reconstrucciones a gran escala de una muestra amplia de estas neuronas, y el análisis de datos cuantitativos basados en la agrupación independiente evaluación estadística. Mediante la combinación de estos métodos, se describe un nuevo enfoque hacia la recopilación y el análisis de los datos neuroanatómicos para facilitar la toma de muestras completa y una clasificación no sesgada de tipos neuronales morfológicamente únicos dentro de una población neuronal selectiva.
Como ejemplo de estos métodos, se describe el análisis de una gran población de neuronas dentro de un solo sector del núcleo reticular talámico (TRN) del mono macaco. Estos datos son de un estudio previo 7. Métodos para marcar selectivamente las neuronas TRN que se proyectan hacia el latera dorsall geniculado núcleo del tálamo (dLGN) mediante inyección quirúrgica del virus de la rabia modificado que codifica la EGFP 4, 8 (véase la Tabla de materiales específicos / Equipos, fila 2) se describen. Este virus de la rabia modificada carece del gen que codifica una proteína de la cubierta esencial, la eliminación de movimiento trans-sináptica del virus. Una vez que el virus entra en terminales de los axones en el sitio de inyección, que actúa como un trazador retrógrado tradicional con la ventaja importante de dirigir la expresión de EGFP en toda la arborización dendrítica completa de las neuronas infectadas 5, 9, 10. Por consiguiente, este virus de la rabia eliminado G-puede ser utilizado para infectar y etiquetar cualquier población neuronal después de la inyección y transporte retrógrado selectivamente.
Con el fin de realizar un análisis exhaustivo de una población neuronal específica, es importante tomar muestras deuna amplia distribución de las neuronas dentro de la población. Debido a que la técnica de etiquetado mediada por virus produce intracelular completa, "Golgi-like" llena de muchas neuronas con axones en el sitio de la inyección del virus, es posible reconstruir una muestra muy grande de las neuronas dentro de la extensión completa de una estructura cerebral. Además, debido a que el virus de la rabia modificado es tan eficaz en infectar y etiquetado de un gran número de neuronas, es posible reconstruir cientos de neuronas por animal. Los procedimientos para el muestreo de 160 neuronas en todo el sector visual de la TRN 11 con el fin de generar una muestra completa de dLGN proyectan neuronas TRN se describen. Se describe el proceso de reconstrucción de las neuronas individuales utilizando un sistema de reconstrucción de las neuronas incluyendo un microscopio, cámara y software de reconstrucción. También se describen métodos para determinar las posiciones de las neuronas individuales dentro de una estructura del cerebro (en este caso dentro de la TRN) y para verificar el virus de la inyección sitel volumen de correo y la ubicación dentro de una estructura (en este caso dentro de la dLGN) usando reconstrucciones volumétricas de contorno. Pasos para exportar los datos morfológicos y realizar agrupación independiente de análisis basados en métricas se describen morfológicos medidos para cada neurona. Existen limitaciones en los métodos de agrupamiento y también hay una variedad de diferentes algoritmos de agrupación disponibles. En consecuencia, se describen estas opciones y las ventajas de algunos de los algoritmos más comúnmente utilizados. El análisis de conglomerados no proporciona una verificación estadística de la singularidad de las agrupaciones. Por lo tanto, los pasos adicionales se describen para verificar la agrupación óptima, así como las relaciones entre los datos morfológicos dentro ya través de las agrupaciones. Métodos estadísticos para evaluar las agrupaciones para el conjunto de datos TRN para confirmar que las neuronas TRN se agrupan en tres grupos únicas basadas en 10 mediciones morfológicas independientes están descritas.
Por lo tanto, delineando los pasos para el etiquetado de forma selectiva, La reconstrucción, y el análisis de datos morfológicos de una población neuronal específica, se describen los métodos para la cuantificación de las diferencias morfológicas entre las neuronas dentro de una población. hallazgos previos de tipos neuronales distintas dentro del sector de la visual de la TRN mono macaco se confirman con métodos distintos de evaluación estadística. Juntos, esperamos que estas técnicas serán ampliamente aplicable a conjuntos de datos neuroanatómicos y ayudar a establecer la clasificación cuantitativa de la diversidad de las poblaciones neuronales a través del cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los estudios neuroanatómicos han seguido siendo un pilar de la neurociencia y la reciente interés en conectómica y relaciones estructura-función ha renovado entusiasmo por la caracterización morfológica detallada de las poblaciones neuronales selectivas. Tradicionalmente, los estudios neuroanatómicos han basado en las clasificaciones cualitativas de las neuronas en clases morfológicamente distintos de neuronas definidas por neuroanatomistas expertos. Con los avances en las técnicas para la reconstrucción de la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los Dres. Ed Callaway y Marty Usrey para permitirnos usar el tejido preparado como parte de un estudio previo y Libby Fairless y Shiyuan Liu para obtener ayuda con reconstrucciones neuronales. Este trabajo fue financiado por el NIH (NEI: EY018683) y la Fundación de Whitehall.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
Riferimenti
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