Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni
Summary
Questo protocollo descrive ricostruzioni su larga scala di popolazioni neuronali selettivi, etichettati dopo l'infezione retrograda con esprimendo un virus della rabbia modificato marcatori fluorescenti, e le analisi di cluster indipendente, imparziale che consentono la caratterizzazione completa delle metriche morfologiche tra sottoclassi neuronali distinti.
Abstract
Questo protocollo delinea le ricostruzioni su larga scala di neuroni in combinazione con l'uso di cluster indipendente e imparziale analisi per creare un'indagine completa delle caratteristiche morfologiche osservate in una popolazione neuronale selettiva. La combinazione di queste tecniche costituisce un nuovo approccio per la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici. Insieme, queste tecniche consentono di larga scala, e quindi più completo, il campionamento delle popolazioni neuronali selettivi e stabilire metodi quantitativi per la descrizione imparziali classi neuronali morfologicamente unici all'interno di una popolazione.
Il protocollo descrive l'uso di virus della rabbia modificato per etichettare selettivamente i neuroni. G-cancellato atti virus della rabbia come tracciante retrogrado seguenti iniezione stereotassica in una struttura di destinazione cerebrale di interesse e serve come veicolo per l'erogazione e l'espressione di EGFP in neuroni. Un gran numero di neuroni sono infettate con questotecnica e di esprimere la GFP per tutta la loro dendriti, la produzione di "Golgi-like" riempimenti completi dei singoli neuroni. Di conseguenza, il metodo di analisi retrograda virus-mediata migliora le tecniche di tracciamento retrogrado tradizionali a base di coloranti con la produzione di riempimenti intracellulari completi.
I singoli neuroni ben isolate che abbracciano tutte le regioni della zona del cervello in fase di studio sono selezionati per la ricostruzione al fine di ottenere un campione rappresentativo di neuroni. Il protocollo delinea le procedure per ricostruire corpi cellulari e completare i modelli arborizzazione dendritiche di neuroni marcati che abbracciano molteplici sezioni di tessuto. dati morfologici, comprese le posizioni di ogni neurone all'interno della struttura del cervello, vengono estratti per ulteriori analisi. funzioni di programmazione standard sono stati utilizzati per eseguire gruppo indipendente analisi e valutazioni cluster basato su metriche morfologiche. Per verificare l'utilità di queste analisi, valutazione statistica di un perfo cluster analysisconfermate su 160 neuroni ricostruite nel nucleo reticolare del talamo del talamo (TRN) del macaco è stato fatto. Sia la cluster analysis originale e le valutazioni statistiche svolte qui indicano che i neuroni TRN sono separati in tre sottopopolazioni, ognuno con caratteristiche morfologiche uniche.
Introduction
Neuroanatomy è uno dei fondamenti delle neuroscienze 1 e recente interesse "connectomics" ha rinnovato entusiasmo per la comprensione della diversità morfologica delle popolazioni neuronali e le connessioni tra i neuroni specifici 2. Metodi per l'etichettatura e neuroni ricostruendo hanno notevolmente migliorato con le recenti innovazioni, tra cui genetica e virus-mediata circuito di tracciamento approcci 3, 4, consentendo studi morfologici più complete delle popolazioni neuronali 5. Oltre a miglioramenti nella etichettatura singoli neuroni, sono anche emerse tecniche di analisi quantitativa dei dati che consentono di classificazione indipendente e imparziale dei neuroni in sottopopolazioni distinte in base a dati morfologici 5, 6. Queste tecniche imparziali sono un miglioramento su più traditional metodi di classificazione qualitativi che sono stati lo standard nel settore per più di un secolo. L'obiettivo di questo studio è quello di delineare, passo dopo passo, la combinazione di etichettatura virus-mediata di neuroni all'interno di una popolazione selettivo, ricostruzioni su larga scala di un campione globale di questi neuroni, e l'analisi quantitativa dei dati basata su cluster indipendente con valutazione statistica. Grazie alla combinazione di questi metodi, delineiamo un nuovo approccio verso la raccolta e l'analisi dei dati neuroanatomici da facilitare la campionatura completa e imparziale la classificazione dei tipi di neuroni morfologicamente unici all'interno di una popolazione neuronale selettiva.
Come esempio di questi metodi, descriviamo la nostra analisi di una vasta popolazione di neuroni all'interno di un singolo settore del nucleo reticolare del talamo (TRN) del macaco. Questi dati provengono da uno studio preliminare 7. Metodi per l'etichettatura selettivamente i neuroni TRN proiettano al Latera dorsalil genicolato nucleo del talamo (dLGN) con iniezione chirurgica del virus della rabbia modificato codifica EGFP 4, 8 (vedi tabella di specifici materiali / attrezzature, fila 2) sono delineati. Questo virus della rabbia modificato manca il gene che codifica una proteina essenziale cappotto, eliminando movimento trans-sinaptica del virus. Una volta che il virus entra terminali degli assoni nel sito di iniezione, si comporta come un tracciante tradizionale retrograda con l'importante vantaggio di guidare espressione EGFP durante l'intero arborization dendritica dei neuroni infettati 5, 9, 10. Di conseguenza, questo virus della rabbia G-cancellato può essere utilizzato per infettare selettivamente etichettare qualsiasi popolazione neuronale dopo l'iniezione e trasporto retrogrado.
Per eseguire un'analisi completa di una specifica popolazione neuronale, è importante campionareun'ampia distribuzione dei neuroni all'interno della popolazione. Poiché la tecnica di etichettatura virus-mediata produce completa intracellulare, "Golgi-like" riempie di molti neuroni con assoni nel sito di iniezione virus, è possibile ricostruire un campione molto ampio di neuroni nella misura massima di una struttura cerebrale. Inoltre, poiché il virus della rabbia modificato è così efficace a infettare ed etichettatura gran numero di neuroni, è possibile ricostruire centinaia di neuroni per animale. Procedure di campionamento 160 neuroni tutto il settore visivo del TRN 11 per generare un campione completo di dLGN sporgenti neuroni TRN sono delineati. Il processo di ricostruzione neuroni individuali utilizzando un sistema di ricostruzione neurone compreso un microscopio, fotocamera e software di ricostruzione è descritto. Anche descritto sono metodi per determinare le posizioni di singoli neuroni all'interno di una struttura del cervello (in questo caso all'interno del TRN) e per verificare il virus iniezione site dal volume e all'interno di una struttura (in questo caso all'interno del dLGN) utilizzando ricostruzioni contorno volumetriche. I passaggi per esportare i dati morfologici ed eseguire gruppo indipendente analisi basate su metriche morfologiche misurati per ogni neurone sono delineati. Ci sono limitazioni per metodi di clustering e ci sono anche una varietà di diversi algoritmi di clustering disponibili. Di conseguenza, sono descritte le opzioni ei vantaggi di alcuni degli algoritmi più comunemente usato. L'analisi dei cluster non prevede la verifica statistica della unicità dei cluster. Pertanto, passaggi aggiuntivi sono delineati verificare raggruppamento ottimale nonché le relazioni tra i dati morfologici all'interno e tra cluster. Metodi statistici per la valutazione cluster per il set di dati TRN per confermare che i neuroni TRN sono raggruppati in tre gruppi unici basato su 10 parametri morfologici indipendenti sono descritte.
Così, delineando passi per selettivamente l'etichettatura, Ricostruendo, e l'analisi dei dati morfologici da una specifica popolazione neuronale, si descrivono i metodi per quantificare le differenze morfologiche tra i neuroni all'interno di una popolazione. risultati precedenti di tipi neuronali distinti all'interno del settore visivo del TRN scimmia macaco sono confermate con separati metodi di valutazione statistica. Insieme, ci auguriamo che queste tecniche saranno ampiamente applicabile a set di dati neuroanatomiche e aiutare a stabilire la classificazione quantitativa della diversità delle popolazioni neuronali attraverso il cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
studi neuroanatomici sono rimasti un pilastro di neuroscienze e recente interesse connectomics e le relazioni struttura-funzione ha rinnovato entusiasmo per la caratterizzazione morfologica dettagliata delle popolazioni di neuroni selettivi. Tradizionalmente, gli studi neuroanatomici hanno fatto affidamento su classificazioni qualitative di neuroni in classi morfologicamente distinte di neuroni definiti da neuroanatomisti esperti. Con i progressi nelle tecniche per la ricostruzione neuroni e l'estrazione dei dati mo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dott. Ed Callaway e Marty Usrey per averci permesso di utilizzare il tessuto preparato come parte di uno studio preliminare e Libby Fairless e Shiyuan Liu per un aiuto con ricostruzioni neuronali. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (NEI: EY018683) e la Fondazione Whitehall.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
Riferimenti
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