Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

Summary

Nous présentons une méthode pour l'isolement et la culture du canal de Wolff de la souris (WD). Nous démontrons également une procédure détaillée pour l'ensemble de l'immunocoloration mont de culture / WDs fraîchement isolés avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude du développement WD, enroulement, et la différenciation.

Abstract

morphogenèse Tubal est une exigence fondamentale pour le développement de la plupart des organes de mammifères, y compris le système reproducteur masculin. L'épididyme, une partie intégrante de l'appareil reproducteur masculin, est responsable de la conservation de sperme, la maturation et le transport. L'épididyme adulte est un tube très enroulé qui se développe à partir d'un précurseur embryonnaire simple et droite connu comme canal de Wolff (WD). lovage correcte de l'épididyme est essentiel pour la fertilité masculine, comme le sperme dans les testicules sont incapables de féconder un ovocyte. Cependant, le mécanisme responsable du développement de l'épididyme et lovage reste incertaine, en partie à cause du manque de culture d'organes et d'imagerie méthodes entières. Dans cette étude, nous décrivons un système de culture in vitro et le protocole entier immunofluorescence mount pour mieux visualiser le processus de WD lovage et le développement, qui peut également être appliquée à l' étude d' autres organes tubulaires.

Introduction

Le système reproducteur mâle se compose essentiellement de testiculaire, le site pour le développement et la différenciation des cellules germinales et un système ductal complexe qui est nécessaire pour la maturation, le transport et le stockage du sperme. Épididyme est un organe tubulaire qui relie testis avec déférent et principalement impliquée dans le développement post-testiculaire et la maturation des cellules germinales ^1. L'épididyme fortement enroulées de souris adulte se développe à partir d' un simple tube et droite précurseur, canal de Wolff (WD) ^1. La structure complexe et enroulée du épididyme est essentiel pour les spermatozoïdes d'acquérir la capacité de fertiliser les cellules germinales femelles ^2. Comment un tel organe essentiel pour la fertilité masculine se développe et se retrouve dans la forme ne sont pas bien compris. Diverses voies de signalisation ont été révélés être impliqués dans le développement de WD telles que la voie de signalisation Wnt ^3,4 et la voie ⁵ de signalisation des androgènes. Nos travaux récents ont mis en place l'exigence de balbrée signalisation Wnt pour WD lovage au cours du développement prénatal ^4. Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes impliqués dans postnatale lovage épididymaire, la différenciation cellulaire, et la communication de cellule à cellule dans l'épithélium de l'épididyme et avec des cellules interstitielles.

Modèles de souris génétiquement modifiées ont été révélés être un outil puissant pour l' identification / validation des mécanismes moléculaires sous – jacents du développement et de la maladie de divers systèmes d'organes ^6. En dépit de son utilisation intensive, il y a des limites importantes de modèles de souris génétiquement modifiés, y compris le phénotype unpredicted de mutants de souris ciblés en ce qui concerne la fonction présumée du gène, et aucun phénotype mutants nuls dans certains modèles, l'influence des facteurs génétiques et environnementaux, de main-d'œuvre et temps processus de développement des modèles de souris. Par conséquent, l'interprétation de la signification des résultats seulement de génétiquement modifiésmodèles de souris fiés est pas toujours simple ^6. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant dans le système de culture d'organe in vitro qui nous donne la souplesse nécessaire pour manipuler les multiples voies de signalisation en temps réel dans des conditions de culture contrôlées. Système de culture d'organes joue un rôle dans la compréhension de la physiologie et de la pathologie des organes entiers ^7. En outre, l' imagerie d'organes entiers colorés avec des anticorps fluorophores marqués nous permet de visualiser les marqueurs d'intérêt dans un contexte tridimensionnel, tel qu'il existe in vivo, fournissant ainsi une meilleure compréhension de la forme de l'organe, la structure et la fonction ^8.

Ici, nous avons décrit les méthodes d'isolement des souris crêtes gonadiques embryonnaires, la culture in vitro et toute la montagne immunofluorescence imagerie de WDs, qui peuvent être appliquées pour répondre à une variété de questions relatives à la morphogenèse des organes tubulaires tels que WDS. Dans ce protocole, nousisolées souris embryonnaires crêtes urogénitales de 15,5 jours après le coït (dpc) barrages enceintes et les cultivées pendant 3 jours, suivi par immunocoloration pour un marqueur des cellules épithéliales (cytokératine 8, CK8), un marqueur de prolifération cellulaire (phospho-histone 3, PH3) et active βcatenin.

Protocol

Les soins et les procédures expérimentales ont été menées en conformité avec les directives du soin et du Comité d'éthique animale de l'Université de Newcastle et confirmé à la Loi sur Nouvelle-Galles du Sud animal recherche, Pays de Galles règlement Animal Research New South, et le code australien pour les soins et utiliser des animaux à des fins scientifiques. Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le soin et Comité d'éthique animale de l'Université de N…

Representative Results

Au cours du développement, le WD subit des changements significatifs dans lequel un tube simple et droite se transforme en un conduit très complexe et enroulé. En utilisant des procédés décrits ci-dessus, WDs subissent une transformation similaire dans des conditions de culture. Ici , nous avons montré les résultats de WDs cultivés pendant 3 d (figure 3). Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse WD, le milieu de culture peut être complétée avec des inhib…

Discussion

Le système de culture d'organe présente de nombreux avantages par rapport au système de culture cellulaire traditionnel. Ce système conserve les relations structurales originales et des interactions entre les différents types de cellules. Il imite dans des systèmes in vivo et donne des informations plus précises que les études de culture cellulaire , où le facteur de niche est absent. L'utilisation de systèmes de culture d'organes ont même des avantages par rapport à l'aide …

Materials

24 well plates	Corning, USA	3524	can be purchased from other vendors
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	can be purchased from other vendors
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034.02	10% FBS used in culture medium
L-Glutamine	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034.01	1% concentration used
Penicillin-Streptomycin	Gibco, USA	15070-063	1% concentration used
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrane (0.8 mm)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µM concentration used
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink
Ethanol	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Very viscous, careful while dispensing
Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Very viscous, careful while dispensing
Di-Sodium Hydrogen Phosphate	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	can be purchased from other vendors
Sodium Di-hydrogen Phosphate	Ajax Finechem, USA	4745-500g	can be purchased from other vendors
Sodium Chloride	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	can be purchased from other vendors
Cytokeratin8/Troma I	Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in blocking buffer
active βcatenin	Cell Signalling Technology,  USA	D13A1	1:200 in blocking buffer
Phospho-Histone3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in blocking buffer
Alexa488 Goat anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in blocking buffer
Alexa594 Goat anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	112-585-072	1:250 in blocking buffer
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	can be purchased from other vendors
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370	–
2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Use to stain nucleic acids (DNA)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Solvent
Cover Slips (24×50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	–