Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas
Summary
Factores epigenéticos pueden interactuar con programas genéticos que modulan la expresión génica y regulan la función de la célula de B. Mediante la combinación de la estimulación in vitro de células B, qRT-PCR y alto rendimiento microARN-secuencia y secuencia de ARNm enfoques, podemos analizar la modulación epigenética de miRNA y expresión genética en las células de B.
Abstract
Respuestas de anticuerpos se logran a través de varios procesos críticos células B intrínsecos, incluyendo la hipermutación somática (SHM), la recombinación del ADN del interruptor de la clase (CSR) y diferenciación de la célula de plasma. En los últimos años, las modificaciones epigenéticas o factores, como la desacetilación de histonas y microRNAs (miRNAs), han demostrado interactuar con programas genéticos de células B en respuestas del anticuerpo forma, mientras que la disfunción de factores epigenéticos se ha encontrado para llevar a respuestas de autoanticuerpos. Análisis de expresión de miRNA y mRNA de genoma en las células B en respuesta a moduladores epigenéticos es importante para comprender la regulación epigenética de la célula de B función y anticuerpo respuesta. Aquí, demostramos un protocolo para la inducción de las células de B para someterse a la diferenciación de la RSE y la célula de plasma, tratar estas células B con inhibidores de histona deacetilasa (HDAC) (IDH) y análisis de expresión de mRNA y microRNA. En este protocolo, se analizan directamente secuencias complementarias de ADN (cDNA) utilizando secuenciación de próxima generación ARNm (ARNm-seq) y tecnologías de miRNA-seq, mapeo de la secuencia se lee y el genoma, la transcripción reversa cuantitativa (qRT)-polimerización en cadena. Con estos planteamientos, hemos definido que, en las células de B inducidas a someterse a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma, IDH, un regulador epigenético, selectivamente modula la expresión de miRNA y mRNA y altera la diferenciación de la RSE y la célula de plasma.
Introduction
Marcas epigenéticas o factores, como la metilación del ADN, modificaciones post-traduccionales de las histonas y RNAs no codificantes (incluyendo microRNA), modulan la función de la célula al alterar la expresión de gen1. Las modificaciones epigenéticas regulan la función de linfocitos B, como la recombinación del ADN de interruptor de la clase de inmunoglobulina (RSE), hipermutación somática (SHM) y diferenciación a células de memoria B o células plasmáticas, tal modo de modulación el anticuerpo y el autoanticuerpo respuestas2,3. RSE y SHM críticamente requieren desaminasa citidina inducida por activación (ayuda, codificado como Aicda), que es altamente inducida en las células B en respuesta a T dependientes y T independientes antígenos4. Las células de B clase-cambiar/hypermutated más diferencian en células plasmáticas, que secretan grandes cantidades de anticuerpos de una manera críticamente dependiente de la proteína de maduración inducida por linfocitos B 1 (Blimp1, codificado como Prdm1)5. Cambios epigenéticos anormales en las células de B pueden resultar en respuestas del anticuerpo/autoanticuerpo aberrante, que pueden conducir a una respuesta alérgica o autoinmunidad1,4. Comprender factores como epigenéticos, como miRNAs, modular B célula-intrínsecas expresión génica no sólo es importante para el desarrollo de una vacuna, pero también es esencial para revelar los mecanismos de posibles respuestas de anticuerpo/autoanticuerpo anormal.
Desacetilación y acetilación de las histonas son modificaciones de los residuos de lisina de las proteínas histonas típicamente catalizadas por histona acetiltransferasa (HAT) e histona deacetilasa (HDAC). Estas modificaciones conducen a la accesibilidad creciente o decreciente de la cromatina y además permitan o evitar el atascamiento de proteínas o factores de transcripción al ADN y la alteración del gen expresión5,6, 7 , 8. inhibidores de las HDACS (IDH) son una clase de compuestos que interfieren con la función de las HDACs. Aquí, utilizamos el IDH (VPA) para abordar la regulación de las HDACS en el perfil de expresión genética intrínseca de las células B y en su mecanismo.
miRNAs son pequeños, no-codificación RNAs aproximadamente 18 a 22 nucleótidos de longitud que se generan a través de varias etapas. miRNA anfitrión genes se transcriben y forman la horquilla microRNA primario (pri-miRNAs). Se exportan al citoplasma, donde los pri-miRNAs más son transformados en miRNAs del precursor (pre-miRNAs). Finalmente, los miRNAs maduros se forman a través de la hendidura de la pre-miRNAs. miRNAs reconocer las secuencias complementarias dentro de lo 3′ región sin traducir de sus mRNAs blanco6,7. A través del silenciamiento postranscripcional, miRNAs regulan la actividad celular, como proliferación, diferenciación y apoptosis de10,11. Varios miRNAs puede apuntar el mismo ARNm, y un único miRNA puede potencialmente objetivo mRNAs múltiple, es importante tener una visión en el contexto del perfil de expresión de miRNA para entender el valor de la persona y el efecto colectivo de miRNAs. miRNAs han demostrado estar involucrados en el desarrollo de células B y diferenciación periférica, así como diferenciación de células B específicas de la etapa, respuesta de anticuerpos y autoinmunidad1,4,9. En el 3′ UTR de Aicda y Prdm1, hay varios sitios evolutivamente conservados validados o previsible que pueden ser objetivo de miRNAs8.
Modulación epigenética, incluyendo la modificación de la transcripción de las histonas y miRNAs, muestran un patrón de regulación específica de la etapa de tipo de la célula y la célula del gene expresión9. Aquí, describimos los métodos para definir la modulación mediada por los IDH de miRNA y expresión de mRNA, RSE y diferenciación de la célula de plasma. Estos incluyen protocolos para la inducción de las células B a la RSE y la diferenciación de la célula de plasma; para el tratamiento de las células B con IDH; y para el análisis de expresión de miRNA y mRNA por qRT-PCR, miRNA-seq y mRNA-seq10,11,12,8,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona enfoques integrales para inducir el cambio de clase de la célula de B y la diferenciación de la célula de plasma; analizar sus efectos epigenéticos moduladores, es decir, IDH; y detectar el efecto del IDH en la expresión de mRNA y miRNA en estas células. La mayoría de estos enfoques puede utilizarse también para analizar el impacto del factor epigenético humano expresión de función y mRNA/miRNA de células B. Los enfoques de mRNA-seq/miRNA-seq y qRT-PCR también pueden utilizarse par…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH 105813 AI y AI 079705 (para PC), la Alianza para la identificación de objetivos de investigación de Lupus en Lupus Grant ALR 295955 (para PC) y la investigación de la Fundación Nacional de investigación de la artritis otorga (en HZ). TS fue apoyado por el centro médico de Pediatría, Hospital de Xiangya segundo, Central South University, Changsha, China, en el marco del programa de visitas de Xiangya UT escuela de Medicina San Antonio estudiante de medicina.
Materials
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | 664 | |
| Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (Size: 6 x 500mL; With L-Glutamine) | Fisher Scientific | MT 10-040-CV | |
| FBS | Hyclone | SH300 | |
| HyClone Antibiotic Antimycotic Solution 100 mL | Fisher Scientific – Hyclone | SV3007901 | |
| β-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | 44-420-3250ML | |
| Falcon Cell Strainers | Fisher Scientific | 21008-952 | |
| Trypan Blue Stain 0.04% | GIBCO/Life Technologies/Inv | 15250 | |
| ACK Lysis Buffer | Fisher Scientific | BW10-548E | |
| Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber | Fisher Scientific | 02-671-51B | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes with Cap | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| EasySep Mouse B cell Isolation Kit | Stem Cell Tech | 19854 | |
| BD Needle Only 18 Gauge 1.5 inch SHORT BEVEL 100/box | BD Biosciences | 305199 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD138 (Syndecan-1) Antibody | BioLegend | 142513 (25 ug) | |
| PE-Cy7 B220 antibody | BioLegend | 103222 | |
| 7-AAD (1 mg) | Sigma Aldrich | A9400-1MG | |
| APC anti-mouse/human CD45R/B220 antibody | Biolegend | 103212 | |
| Mouse APC-IgG1 200 µg | Biolegend | 406610 | |
| FITC anti-mouse IgM Antibody | Biolegend | 406506 | |
| FITC anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | Biolegend | 103206 | |
| PE Anti-Human/Mouse CD45R (B220) (RA3-6B2) | Biolegend | 103208 | |
| HBSS 1X | Fisher Scientific | MT-21-022-CM | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| LPS 25mg (Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5) | Sigma Aldrich | L2880-25MG | |
| Recombinant mouse IL-4 (carrier-free) | BioLegend | 574302 (size: 10 ug) | |
| Valproic acid sodium salt | Sigma Aldrich | P4543 | |
| SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet | The Baker Company | SG404 | |
| Large-Capacity Reach-In CO2 Incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
| Isotemp Digital-Control Water Baths: Model 205 | Fisher Scientific | 15-462-5Q | |
| 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Fisher Scientific | 14-959-5 | |
| Corning CentriStar 15ml Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-538-59A | |
| 1.7 mL Microtube, clear | Genesee | 22-282 | |
| Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes 50ml | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| ELMI SkySpin CM-6MT | ELMI | CM-6MT | |
| Rotor 6M | ELMI | 6M | |
| Rotor 6M.06 | ELMI | 6M.06 | |
| Drummond Portable Pipet-Aid XP Pipet Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| 25 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-900 | |
| 10 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 89130-898 | |
| 5 mL serological pipette tips | Fisher Scientific | 898130-896 | |
| 48-well plates | Fisher Scientific | 07-200-86 | |
| Allegra 6 Benchtop Centrifuge, Non-Refrigerated | Beckman Coulter | 366802 | |
| GH-3.8A Rotor, Horizontal, ARIES Smart Balance | Beckman Coulter | 366650 | |
| Allegra 25R Benchtop Centrifuge, Refrigerated | Beckman Coulter | 369434 | |
| TA-15-1.5 Rotor, Fixed Angle | Beckman Coulter | 368298 | |
| Fisher Scientific AccuSpin Micro 17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
| miRNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 217004 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep kit | Zymo Research | R2050 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Rnase-Free Dnase set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometers | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Superscript III First-strand Synthesis System RT-PCR | Invitrogen | 175013897 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-rad | 172-5121 | |
| Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR Plates, case of 25 | Fisher | 14-230-244 | |
| Microseal 'B' Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| MyiQ Optics Module | Bio-Rad | 170-9744 | |
| iCycler Chassis | Bio-Rad | 170-8701 | |
| Optical Kit | Bio-Rad | 170-9752 | |
| BD LSR II Flow Cytometry Analyzer | BD Biosciences | ||
| FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10 | BD Biosciences | ||
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2943CA | |
| S200 Focused-ultrasonicator | Covaris | S200 | |
| SPRIworks Fragment Library System I for Illumina | Beckman Coulter | A288267 | |
| cBot Cluster Generation Station | illumina | SY-312-2001 | |
| HiSeq 2000 Genome Sequencer | Illumina | SY-401-1001 | |
| TruSeq RNA Library Prep Kit v2 | Illumina | RS-122-2001 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| NEXTflex Illumina Small RNA Sequencing Kit v3 | Bioo Scientific | 5132-05 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2964AA |
Riferimenti
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