एकल कोशिका अनुक्रमण उच्च संकल्प पर जीनोमिक परिवर्तन के समाधान के लिए एक तेजी से लोकप्रिय और सुलभ साधन है। हम एक प्रोटोकॉल एकल कक्ष अनुक्रमण का उपयोग करता है एकल कक्षों में नकल संख्या परिवर्तन की पहचान करने के लिए प्रदान करते हैं।
एकल कक्ष संकल्प पर जीनोमिक परिवर्तन का पता लगाने सामान्य ऊतकों, कैंसर, और माइक्रोबियल आबादी में आनुवंशिक विविधता और विकास निस्र्पक के लिए महत्वपूर्ण है। आनुवंशिक विविधता का आकलन करने के लिए पारंपरिक तरीकों कम संकल्प, कम संवेदनशीलता, और / या कम विशिष्टता द्वारा सीमित किया गया है। एकल कोशिका अनुक्रमण उच्च संकल्प, उच्च संवेदनशीलता और, जब उचित विश्लेषण किया, उच्च विशिष्टता के साथ आनुवंशिक विविधता का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है। यहाँ हम अलगाव, पूरे जीनोम प्रवर्धन, अनुक्रमण, और विश्लेषण एकल कक्षों के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हमारा दृष्टिकोण एकल कक्षों में megabase पैमाने पर नकल संख्या वेरिएंट के विश्वसनीय पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल के पहलुओं को भी एकल कक्षों में आनुवंशिक परिवर्तन के अन्य प्रकार की जांच के लिए लागू किया जा सकता है।
डीएनए नकल संख्या में बदलाव कई आधार जोड़े से आकार में लेकर कर सकते हैं (प्रतिलिपि संख्या वेरिएंट) (CNVs) पूरे गुणसूत्रों (aneuploidy) करने के लिए। नकल संख्या जीनोम के बड़े क्षेत्रों को प्रभावित करने परिवर्तन अप जीन 1, 2 के हजारों करने की अभिव्यक्ति बदलकर महत्वपूर्ण प्ररूपी परिणाम हो सकते हैं। CNVs कि आबादी के सभी कोशिकाओं में मौजूद थोक अनुक्रमण या माइक्रोएरे आधारित विधियों 3, 4 से पता लगाया जा सकता है। हालांकि, आबादी भी आनुवंशिक रूप से विषम हो सकता है, आबादी या यहां तक कि एकल कक्षों के एक सबसेट में मौजूदा CNVs के साथ। जेनेटिक विविधता, सामान्य ऊतकों में मौजूद कैंसर में आम है, ट्यूमर के विकास ड्राइविंग, और भी अज्ञात परिणाम 5, 6, 7, 8, 9 के साथ <sup>, 10।
परंपरागत रूप से, आनुवंशिक विविधता या तो कोशिकीय दृष्टिकोण या थोक अनुक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। ऐसे सीटू संकरण (मछली), गुणसूत्र फैलता है, और वर्णक्रमीय karyotyping (आकाश) में प्रतिदीप्ति के रूप में कोशिकीय दृष्टिकोण, व्यक्ति की कोशिकाओं में उपस्थित पहचान के परिवर्तन का लाभ उठा रहे हैं लेकिन संकरण और 11 के प्रसार की कलाकृतियों के कारण उच्च त्रुटि दर है। इन तरीकों को भी अपने संकल्प-ही खुलासा प्रतिलिपि संख्या में सीमित कई megabases फैले परिवर्तन कर रहे हैं। अनुक्रमण या थोक डीएनए के प्रोटीन, हालांकि सटीकता और संकल्प में उच्च, कम संवेदनशील है। आदेश में जनसंख्या आधारित दृष्टिकोण से आनुवंशिक विविधता का पता लगाने के लिए, वेरिएंट आबादी में कोशिकाओं का एक बड़ा अंश में मौजूद होना चाहिए। तरीकों एकल कक्षों से जीनोमिक डीएनए बढ़ाना के उद्भव यह एकल कक्षों के जीनोम अनुक्रम को संभव बना दिया है। एकल कोशिका sequencing उच्च संकल्प, उच्च संवेदनशीलता, और, जब उचित गुणवत्ता नियंत्रण विधियों लागू कर रहे हैं, उच्च सटीकता 12 के फायदे हैं।
यहाँ, हम एकल कक्षों में megabase पैमाने पर नकल संख्या परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन है। हम microaspiration द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग, जीनोमिक डीएनए बढ़ाना लिंकर-एडाप्टर पीसीआर का उपयोग कर, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार है, और पता लगाने प्रतिलिपि संख्या दोनों छिपे हुए मार्कोव मॉडल और परिपत्र द्विआधारी विभाजन से वेरिएंट।
परंपरागत रूप से, एक ऐसी मछली और आकाश के रूप में कोशिकीय तरीकों आवश्यक कोशिकाओं के स्तर पर CNVs और aneuploidy पहचान। अब, एकल कोशिका अनुक्रमण इस तरह के सवालों के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उभरा है। क्योंकि यह दोनों जीनोम चौड़ा और उच्च संकल्प है एकल कोशिका अनुक्रमण मछली और आकाश पर फायदे हैं। इसके अलावा, जब उचित गुणवत्ता नियंत्रण विधियों लागू कर रहे हैं, एकल कोशिका अनुक्रमण CNVs का एक और अधिक विश्वसनीय आकलन और aneuploidy प्रदान कर सकते हैं के रूप में यह मछली और आकाश को निहित संकरण और प्रसार कलाकृतियों के लिए अतिसंवेदनशील नहीं है। हालांकि, एकल कोशिका अनुक्रमण के हाल के अनुप्रयोगों के कई संवेदनशीलता का पूरी तरह से आकलन और तरीकों की विशिष्टता की पुष्टि नहीं की गई है और विश्लेषण करती है। दरअसल, विश्लेषणात्मक अन्य अध्ययनों द्वारा इस्तेमाल के तरीकों में से कुछ झूठी सकारात्मक CNV कॉल 12 के उच्च आवृत्तियों (> 50%) के साथ जुड़े रहे हैं। दृष्टिकोण का वर्णन हम कड़ाई से केएन की कोशिकाओं का उपयोग कर परीक्षण किया गया हैआदेश में सही और गलत की खोज की दरों का निर्धारण और संवेदनशीलता और CNV का पता लगाने के 12 की विशिष्टता का अनुकूलन करने में खुद CNV बोझ। गुणवत्ता नियंत्रण और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण इस प्रोटोकॉल में वर्णित, 5 एमबी लाभ का लगभग 20%, 5 एमबी नुकसान के 75%, और सभी CNVs 10 एमबी से अधिक उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। हालांकि एकल कक्ष अनुक्रमण के झूठे खोज दर का निर्धारण करने के लिए कठिन है, हम इसे 25% से कम होने का अनुमान है। इस प्रोटोकॉल के स्रोतों की विविधता से कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, लिपियों CNV का पता लगाने के संकल्प को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और प्रोटोकॉल जीनोमिक परिवर्तन के अन्य प्रकारों की पहचान करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
वहाँ एकल कक्षों में ताजा ऊतकों को अलग कर के साधनों की एक किस्म है, और कई प्रकाशनों ऐसी त्वचा 24 और मस्तिष्क 25 के रूप में विशिष्ट ऊतकों के लिए अनुकूलित प्रक्रियाओं, का वर्णन है। हम microaspiration द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए पसंद के रूप में इसके लिए अनुमति देता है प्रत्येक कोशिका के आर दृश्य मूल्यांकन अनुक्रम किया जा सके। हालांकि, यह भी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 26 और 27 microfluidic उपकरणों द्वारा एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए संभव है। तो एकल कक्ष अलगाव और पूरे जीनोम प्रवर्धन मैन्युअल किया जाता है, यह अलग और एक बैठे ही में चालीस कोशिकाओं के लिए ऊपर बढ़ाना उचित है। आदेश में उच्च गुणवत्ता एकल कक्ष अनुक्रमण डेटा प्राप्त करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि एकल कोशिका जीनोम के प्रवर्धन वर्दी और पूरा हो गया है। हम एकल कक्षों की गुणवत्ता सेल और प्रवर्धन की दक्षता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अलग-थलग अनुक्रमण डेटा की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि लगता है। जैसे, कोशिकाओं अलगाव और पूरे जीनोम प्रवर्धन करने के लिए बस से पहले उनके पैतृक वातावरण से काटा जाना चाहिए शुरू करना चाहिए तुरंत बाद कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं। इसके अलावा, सेल और विखंडन कदम वास्तव में कदम 2.3-2.6 में वर्णित के रूप में पालन किया जाना चाहिए।
"> एल्गोरिदम संवेदनशीलता और विशिष्टता 12 पर प्रभाव का विरोध करने के साथ, CNV का पता लगाने के संकल्प को बदलने के लिए समायोजित किया जा सकता है। यह भी tetraploidy 11 की सेटिंग में पूरे गुणसूत्र aneuploidy पता लगाने के लिए थ्रेसहोल्ड समायोजित करने के लिए संभव है। हालांकि, हम पाते हैं कि हमारे दृष्टिकोण, CNVs से अधिक 5 एमबी का पता लगाने के लिए सीमित है के रूप में पूरे जीनोम प्रवर्धन के दौरान पेश शोर छोटे वेरिएंट 12 का पता लगाने के पेचीदा हो। पूरे जीनोम प्रवर्धन दृष्टिकोण में भविष्य में सुधार अंततः एकल कक्ष अनुक्रमण का उपयोग CNV का पता लगाने के संकल्प को बढ़ाने चाहिए।एकल कोशिका अनुक्रमण न केवल नकल संख्या परिवर्तन की जांच, लेकिन यह भी एकल nucleotide रूपों 28, 29 और संरचनात्मक बदलाव 30 के लिए अनुमति देता है। एकल कक्ष अलगाव के लिए हमारी प्रोटोकॉल इन अन्य कुए जवाब देने के लिए लागू किया जा सकताstions। हालांकि, पूरे जीनोम प्रवर्धन विधि का चुनाव विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करता है। विधि इस प्रोटोकॉल है, जो पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन पर आधारित है में वर्णित है, सबसे अच्छा है क्योंकि यह प्रवर्धन पूर्वाग्रह 32 के निचले स्तर के साथ जुड़ा हुआ है प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन का पता लगाने के लिए अनुकूल है। ऐसे एकल nucleotide बहुरूपताओं के रूप में जीनोमिक परिवर्तन, के अन्य प्रकार की जांच के लिए, पूरे जीनोम प्रवर्धन के अन्य तरीकों के 31, 32 और अधिक उपयुक्त माना जाता है।
The authors have nothing to disclose.
हम इस पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए स्टुअर्ट लेविन धन्यवाद। इस काम के स्वास्थ्य अनुदान GM056800 के राष्ट्रीय संस्थानों और कैथी और रूखा संगमरमर कैंसर रिसर्च फंड एंजलिका आमोन करने से और कॉख संस्थान सहायता अनुदान P30-CA14051 द्वारा समर्थित किया गया था। एंजलिका आमोन भी हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट और जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए ग्लेन फाउंडेशन के एक अन्वेषक है। काक NIGMS प्रशिक्षण अनुदान T32GM007753 द्वारा समर्थित है।
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177 | |
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot) | VWR | 89068-500 | |
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches) | VWR | 89068-508 | |
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 um) | VWR | 28144-040 | |
Serological pipette (5 ml) | BioExpress | P-2837-5 | Any plastic 5 mL pipette should suffice |
In-Line Water Trap for Oxygen Use | Amazon.com | 700220210813 | |
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length) | VWR | 34502-99 | |
Modeling clay | VWR | 470156-850 | |
Petri dish (150 mm diameter) | VWR | 25384-326 | Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells |
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates | Bio-Rad | HSS9601 | Any 96-well PCR plate should suffice |
96-well tissue culture plate | VWR | 62406-081 | Any 96-well tissue culture plate should suffice |
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit | Sigma | WGA4 | |
Microseal 'A' Film | Bio-Rad | MSA5001 | |
Mini plate spinner | Thomas Scientific | 1225Z37 | |
Thermal cycler | Bio-Rad | 1861096 | Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate |
Agencourt Ampure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
Dynamag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Any similar magnetic tube strip should suffice |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-121-1012 | |
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480) | Kapa Biosystems | KK4845 | This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine. |