यहाँ, हम लीजोनेला pneumophila (एल pneumophila) तरल संस्कृतियों से बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMVs) की शुद्धि का वर्णन है। ये शुद्ध पुटिकाओं तो मैक्रोफेज के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं उनके समर्थक भड़काऊ संभावित विश्लेषण करने के लिए।
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
जीवाणु अलग तंत्र के माध्यम से 1 विषैलापन कारकों छिपाना कर सकते हैं। जाने-माने स्रावी सिस्टम इसके अलावा, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के बारे में जानकारी का आदान-प्रदान और बाहरी झिल्ली पुटिकाओं (OMVs), जो छोटे हैं, अंडाकार आकृति पुटिकाओं व्यास में 10-300 एनएम और एक bilayered झिल्ली संरचना के साथ के माध्यम से डाह कारकों वितरित कर सकते हैं। वे विकास के वातावरण (तरल संस्कृति, ठोस संस्कृति, और biofilms) की एक किस्म में और सभी विकास के चरण 2, 3 में स्रावित होते हैं। OMVs परिवहन का एक महत्वपूर्ण साधन हैं (जैसे, के लिए प्रोटीन, adhesins, जहर, और एंजाइमों, साथ ही साथ के लिए LPS, OMV सतह पर पाया जाता है) 4। Intraluminal माल प्रोटिओलिटिक गिरावट से सुरक्षित है, तो यह लंबी दूरी पर कार्य करने के लिए सक्षम है, और पुटिकाओं शरीर के तरल पदार्थ और दूर के अंगों 5, 6 में पाया जा सकता है,"xref"> 7, 8। वे केवल मान्यता प्राप्त नहीं किया जा सकता है और कोशिकाओं 9, 10 से ऊपर ले लिया है, लेकिन इसके अलावा, वे मेजबान कोशिकाओं 4 में बैक्टीरिया और उनके आक्रमण के बंधन की सुविधा के लिए सक्षम हैं। लीजोनेला pneumophila (एल pneumophila) एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु कि OMVs जारी कर सकते है। मानव फेफड़ों में, यह मुख्य रूप से वायुकोशीय मैक्रोफेज को संक्रमित करता है, भले ही अपनी प्राकृतिक मेजबान मीठे पानी अमीबा 11 हैं। एक एल pneumophila संक्रमण Legionnaires रोग, निमोनिया 12 की एक गंभीर रूप हो सकता है। यह ब्लॉक फेगोसोम-lysosome मेजबान कोशिका में संलयन। यह भी मेजबान अंगों जिससे एक प्रतिकृति आला, लीजोनेला युक्त रिक्तिका (एलसीवी), 13, 14 का गठन किया है रंगरूटों। लाइसोसोमल गिरावट न केवल प्रेरक प्रोटीन टीआरए से हिचकतेप्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली के माध्यम से, लेकिन यह भी OMVs 15 की रिहाई के द्वारा nslocation।
बैक्टीरियल संस्कृतियों से OMVs की शुद्धि प्राप्तकर्ता कोशिकाओं पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है। इससे पहले एल pneumophila OMVs में प्रोटीन की मात्रा पर और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं 16 है, लेकिन मानव फेफड़े के ऊतकों प्रत्यारोपण के साथ बाद में पढ़ाई पर पुटिकाओं के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित अध्ययन दिखा कि एल pneumophila OMVs वायुकोशीय मैक्रोफेज 17 द्वारा लिया जाता है।
OMVs वर्तमान रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs) और अन्य जीवाणु एंटीजन के रूप में, वे कोशिकाओं के संक्रमण पर प्रभाव पड़ता है और मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 18 मिलाना हो सकता है। एल pneumophila OMVs तेजी से मेजबान कोशिका झिल्ली के साथ फ्यूज और, इसके अलावा, वे झिल्लीदार TLR2 19 को सक्रिय करें। ऐसा नहीं है कि एल pneumoph के रूप में जाना जाता हैइला OMVs एक समर्थक भड़काऊ तरीके से 16, 17 में मैक्रोफेज और उपकला कोशिकाओं को उत्तेजित, हम मानव और murine मैक्रोफेज में संक्रमण की प्रक्रिया पर OMVs के प्रभाव का विश्लेषण किया।
यहाँ, हम अंतर ultracentrifugation द्वारा secreted OMVs अलग-थलग करने और यूकेरियोटिक मेजबान कोशिकाओं पर पुटिकाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए, या तो सीधे या एक संक्रमण के बाद तरल संस्कृति में एल pneumophila की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
बैक्टीरियल रोगज़नक़ों और उनके लक्ष्य कोशिकाओं पर इन झिल्ली पुटिकाओं के प्रभाव का OMVs वर्तमान में अधिकता का अध्ययन किया जा रहा है। उदाहरण के लिए, क्लोस्ट्रीडियम perfringens व्युत्पन्न OMVs मैक्रोफेज में साइटोकाइन स्राव को प्रेरित, बी लिम्फोसाइट Borrelia burgdorferi से OMVs से सक्रिय किया जा सकता है, और हेलिकोबेक्टर -released झिल्ली पुटिकाओं गैस्ट्रिक उपकला कोशिकाओं 21, 22, 23 पर कार्रवाई कर सकते हैं। एल pneumophila, एक intracellular रोगज़नक़ कि असामान्य निमोनिया की एक गंभीर रूप पैदा कर सकते हैं, यह भी OMVs कि फेफड़ों उपकला कोशिकाओं और मैक्रोफेज 16, 19 को सक्रिय करने में सक्षम हैं विज्ञप्ति। यहाँ, हम तरल संस्कृति से एल pneumophila OMVs के छोटे पैमाने पर अलगाव निमोनिया में OMVs की संभावित भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह बाँझ Condit के तहत काम करने के लिए महत्वपूर्ण हैआयनों और आदेश में एक शुद्ध एल pneumophila प्राप्त करने के लिए अन्य बैक्टीरिया से संक्रमण से बाहर शासन करने के लिए OMV तैयारी व्युत्पन्न। OMVs के अलगाव के क्रम में, एल pneumophila के साथ प्राप्त OMV गोली के प्रदूषण को रोकने के लिए भले ही यह OMV उपज कम कर देता है, के बाद से सबसे बड़ा OMVs इस निस्पंदन कदम से खो रहे हैं में 0.22 माइक्रोन छिद्रों के माध्यम से एक निस्पंदन कदम भी शामिल है।
इसके अलावा, हम और अधिक बारीकी से लीजोनेला निमोनिया, जहां OMVs कोशिकी बैक्टीरिया 15 से एलसीवी के अंदर जारी कर रहे हैं में स्थिति लगभग करने के लिए उन पृथक पुटिकाओं और एल pneumophila से संक्रमित कोशिकाओं को मानव और murine मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया। नियोजित OMV खुराक ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद मानव मैक्रोफेज की इन विट्रो संक्रमण में मुफ्त OMV राशि के अनुसार अनुमान लगाया गया है (संदर्भ 20 में वर्णित)। अन्य प्राप्तकर्ता कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए या विवो प्रयोगों में,अन्य OMV खुराक आवश्यक हो सकता है और स्थापित किया जाना चाहिए। एल pneumophila OMVs के प्रभाव का विश्लेषण प्रोटोकॉल Jager और Steinert 24 द्वारा वर्णित करने के लिए एक प्रगति का प्रतिनिधित्व करता।
इधर, पीएमए विभेदित THP-1 कोशिकाओं प्राथमिक मानव सामग्री की सीमित उपलब्धता के कारण वायुकोशीय मैक्रोफेज के लिए एक मॉडल के रूप में सेवा करते हैं। पीएमए के अलावा मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह 25 में monocytic THP-1 कोशिकाओं differentiates। इसके अलावा, वे एल pneumophila के लिए एक प्रसिद्ध मॉडल सेल लाइन अध्ययन 26 कर रहे हैं। इस मानव monocytic सेल लाइन इसके अलावा, mBMDM कोशिकाओं का इस्तेमाल किया जाता है। mBMDM व्यापक रूप से एल pneumophila 27, 28, 29 के प्रभाव के अध्ययन के लिए स्वीकार कर रहे हैं। अलग TLRs या अन्य प्रोटीन के लिए आनुवंशिक नॉकआउट उपयोग करने की संभावना उन्हें OMV प्रभाव के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनाते हैं। ORD मेंप्रयोग के प्रति चूहों की राशि को कम करने के लिए एर, mBMDM मैक्रोफेज की सीमाओं के कारण वायुकोशीय मैक्रोफेज के बजाय प्रयोग किया जाता है। कुंजी प्रयोगों सत्यापन के लिए वायुकोशीय मैक्रोफेज की आवश्यकता हो सकती है।
Ultracentrifugation के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल OMVs शुद्ध करने के लिए इसके अलावा, यह एक घनत्व ढाल centrifugation, जो Chutkan एट अल द्वारा प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है प्रदर्शन करने के लिए संभव है। 30। यह प्राप्त OMV तैयारी की शुद्धता में सुधार और सह शुद्ध प्रोटीन समुच्चय, flagellin, और LPS की मात्रा को कम कर सकता है। प्राप्त OMV तैयारी की पवित्रता संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा या गुणवत्ता नियंत्रण में एक अनुपूरक कदम के रूप में nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। इस प्रोटीन माप प्रक्रिया यहाँ प्रस्तुत परे, गुणात्मक रूप से एक अतिरिक्त साधन प्रदान कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, एलपीएस एकाग्रता एक Limulus amebocyte lysate परीक्षण से विश्लेषण किया जा सकता है। OMV उपज कम है, तो एककेन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से अतिरिक्त एकाग्रता कदम प्रदर्शन किया जा सकता है, जो यहाँ नहीं किया गया था। तो उपज की उम्मीद से कम रहा, OMVs खारिज कर दिया गया था।
OMVs पीछे जैविक तंत्र और कार्यों को स्पष्ट करने के लिए चल रहे प्रयास के तहत, OMV उत्पादन पर अलग तनाव की स्थिति के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है। पोषक तत्वों के अभाव, हानिकारक एजेंटों के लिए ऊष्मायन के तापमान, या जोखिम में परिवर्तन OMV स्राव 31 पर एक प्रभाव हो सकता है। संभावित तनाव की स्थिति Klimentova और Stulik 32 से प्रोटोकॉल में चर्चा कर रहे हैं। इसके अलावा, अति या hypovesiculating एल pneumophila म्यूटेंट उत्पन्न किया जा सकता है। अलग OMV की तैयारी तो मैक्रोफेज, मानव फेफड़े के ऊतकों explants (संदर्भ 17 में वर्णित), या यहां तक कि इन विवो मॉडल में संक्रमण के साथ प्रयोगों में विश्लेषण किया जा सकता है। सहज प्रतिरक्षा संकेतन में OMVs की भूमिका, बैक्टीरियल संचार में उनके प्रभाव के अलावाप्रयोगात्मक संबोधित किया जा सकता। इसके अलावा, विभिन्न सहज प्रतिरक्षा cascades संकेत के प्रभाव murine पीटकर कोशिकाओं के उपयोग या मानव कोशिका लाइनों में CRISPR / Cas9 नॉकआउट की पीढ़ी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। OMVs में यह बुनियादी अनुसंधान नया टीका रणनीति है, जो पहले से ही नेइसेरिया meningitides 33 के माध्यम से प्रेषित मेनिनजाइटिस बी के लिए मौजूद हैं के विकास में मदद करेंगे।
OMV अलगाव और लक्षण पर प्रोटोकॉल से शुरू, एक अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और अन्य मेजबान कोशिकाओं को यह आवेदन कर सकते हैं; यह केवल तरल संस्कृति में बैक्टीरिया की वृद्धि को समायोजित करने की जरूरत है। प्रोटोकॉल Chutkan एट अल द्वारा प्रकाशित किया। कोलाई और Pseudomonas aeruginosa 30 से OMVs की पीढ़ी के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। संस्कृति के आदेश और lysed बैक्टीरिया में बढ़ जाती है contaminating प्रोटीन और मेम से बचने के लिए देर से स्थिर चरण तक पहुंचने नहीं करना चाहिएbranes। इसके अतिरिक्त, मेजबान कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया OMV खुराक, विवो में संक्रमण के दौरान OMVs वर्तमान की राशि के अनुसार निर्धारित किया जाना है, जबकि अभी भी cytotoxicity की कम दर सुनिश्चित करने की जरूरत है। इस तरह, OMVs के रोग भूमिका, अंतर-प्रजाति संचार, और मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर उनके प्रभाव की जांच की जा सकती है।
आगे निमोनिया में एल pneumophila OMVs की भूमिका का अध्ययन करने के लिए, पर्याप्त पैदावार और तुलनीय संक्रमण प्रयोगों के साथ मानकीकृत OMV की तैयारी की जरूरत है। इस प्रोटोकॉल अलगाव प्रक्रियाओं का मानकीकरण करने और अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और अन्य मेजबान कोशिकाओं को OMV अध्ययन का विस्तार करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, अनुसंधान विट्रो ज्ञान है, जो इन विवो सेटिंग्स करने के लिए प्रयोगों का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में विस्तृत से लाभ होगा। भविष्य में, इस तरह के प्रोटोकॉल सीरम या ब्रोन्कोएल्वियोलर लव के रूप में प्राथमिक जैविक सामग्री से OMVs, के अलगाव के लिए बढ़ाया जा सकता हैउम्र तरल पदार्थ, OMVs की संरचना शारीरिक शर्तों के तहत जारी किया गया में जानकारी हासिल करने के लिए। इस OMV रचना के प्रमुख मानकों का निर्धारण करने के लिए और इन विट्रो -generated OMVs के गुणों को समझने में मदद मिलेगी।
The authors have nothing to disclose.
हम TLR2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रो डॉ मार्कस Schnare धन्यवाद – / – और TLR2 / 4 – / – चूहों और Trif / MyD88 के लिए प्रो डॉ कार्स्टन किरशनिंग – / – चूहों। इस काम के कुछ हिस्सों Bundesministerium फर Bildung und Forschung द्वारा वित्त पोषित किया गया (ई: जैव miRSys – FKZ 0316175B, ई: मेड CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), और Hessisches Ministerium फर Wissenschaft und Kunst (LOEWE मेडिकल RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), सभी बी एस।
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |