Her beskriver vi rensing av Legionella pneumophila (L. pneumophila) ytre membranblærer (OMVS) fra flytende kulturer. Disse rensede vesikler blir så brukt for behandling av makrofager for å analysere deres pro-inflammatorisk potensial.
Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.
Bakterier kan skille ut virulensfaktorer via ulike mekanismer 1. Foruten de kjente sekretoriske systemer kan gram-negative bakterier utveksle informasjon og leverer virulensfaktorer via yttermembran vesikler (OMVS), som er små, sfæroide vesikler 10-300 nm i diameter og med en bilayered membranstruktur. De blir utskilt i en rekke vekstmiljøer (flytende kultur, fast kultur, og biofilm) og i alle vekstfaser 2, 3. OMVS er et viktig virkemiddel for transport (for eksempel for proteiner, adhesinene, giftstoffer og enzymer, samt for LPS, som finnes på OMV overflaten) 4. Den intraluminale lasten er beskyttet fra proteolytisk nedbrytning, slik at det er i stand til å virke over lange avstander, og vesiklene kan finnes i kroppsvæsker og fjerntliggende organer 5, 6,"xref"> 7, 8. De kan ikke bare bli gjenkjent og tas opp av eukaryote celler 9, 10, men dessuten er de i stand til å lette binding av bakterier og deres invasjon i vertsceller 4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) er en Gram-negativ bakterie som kan slippe OMVS. I den menneskelige lunge, det smitter primært alveolære makrofager, selv om dens naturlige verts er ferskvann amøber 11. En L. pneumophila infeksjon kan forårsake legionellose, en alvorlig form for lungebetennelse 12. Den blokkerer phagosome-lysosome fusjon i vertscellen. Det rekrutterer også vertsorganeller, der en replikering nisje, den legionella-holdige vakuole (LCV), er dannet 13, 14. Lysosomal degradering er hemmet ikke bare av effektor protein translocation via type IV sekresjon system, men også ved utgivelsen av OMVS 15.
Rensingen av OMVS fra bakteriekulturer er nødvendig for å analysere deres effekt på mottakercellene. Tidligere studier fokusert på proteininnholdet i L. pneumophila OMVS og på påvirkning av vesiklene på alveolære epitelceller 16, men senere studier med human lungevev transplantasjoner vist at L. pneumophila OMVS er tatt opp av alveolære makrofager 17.
Som OMVS nåværende patogen-forbundet molekylære mønstre (PAMPs) og andre bakterielle antigener, de kan ha en innvirkning på infeksjon av eukaryote celler og modulere vertens immunrespons 18. L. pneumophila OMVS raskt smelter med vertscellemembraner, og dessuten de aktiverer membran TLR2 19. Som det er kjent at L. pneumophILA OMVS stimulere makrofager og epiteliale celler i et pro-inflammatorisk måte 16, 17, analyserte vi virkningen av OMVS på infeksjonsprosessen i humane og murine makrofager.
Her beskriver vi en protokoll for dyrking av L. pneumophila i flytende kultur for å isolere de utskilte OMVS av differensialultrasentrifugering og for å vurdere effekten av vesiklene på eukaryote vertsceller, enten direkte eller etter en infeksjon.
De OMVS av bakterielle patogener og virkningen av disse membranvesikler på sine målcellene blir nå nøye studert. For eksempel, Clostridium perfringens-avledede OMVS indusere cytokin sekresjon i makrofager, kan B-lymfocytter aktiveres ved OMVS fra Borrelia burgdorferi, og Helicobacter pylori -released membranvesiklene kan virke på mage epitelceller 21, 22, 23. L. pneumophila, en intracellulær patogen som kan forårsake en alvorlig form for atypisk lungebetennelse, også utgivelser OMVS som er i stand til å aktivere lunge epitelceller og makrofager 16, 19. Her presenterer vi en detaljert protokoll for småskala isolering av L. pneumophila OMVS fra flytende kultur å studere potensielle rolle OMVS i lungebetennelse. Det er viktig å arbeide under sterile conditioner og for å utelukke forurensning fra andre bakterier for å oppnå en ren L. pneumophila-avledede OMV preparat. Isoleringen av OMVS omfatter et filtreringstrinn gjennom 0,22 um porer for å hindre forurensning av det oppnådde OMV pellet med L. pneumophila, selv om dette reduserer utbyttet OMV, siden de største OMVS går tapt ved denne filtreringstrinn.
Videre har vi testet responsen av menneskelige og murine makrofager til de isolerte vesikler og infiserte celler med L. pneumophila å nærmere tilnærmet situasjonen i Legionella lungebetennelse, hvor OMVS frigis inne i LCV av ekstracellulære bakterier 15. De anvendte OMV doser er beregnet i henhold til den frie OMV mengde i et in vitro infeksjon av humane makrofager etter 24 timers inkubering (beskrevet i referanse 20). For stimuleringen av andre mottakercellene eller in vivo-forsøk,andre OMV doser kan være nødvendig og må etableres. Analysen av effekten av L. pneumophila OMVS representerer et opprykk til protokollen beskrevet av Jager og Steinert 24.
Her, PMA-differensierte THP-1-celler som tjener som en modell for alveolære makrofager på grunn av den begrensede tilgjengelighet av primære humane materiale. Tilsetningen av PMA skiller de monocytiske THP-1-celler til makrofaglignende celler 25. Videre er de en velkjent modell cellelinje for L. pneumophila studerer 26. I tillegg til denne human monocyttisk cellelinje, blir mBMDM celler anvendt. mBMDM er allment akseptert for studier av effekten av L. pneumophila 27, 28, 29. Muligheten for å bruke genetisk knockouts for ulike TLRs eller andre proteiner gjør dem til et verdifullt verktøy for å studere OMV effekter. i order å redusere mengden av mus per eksperiment, blir mBMDM brukt i stedet for alveolære makrofager på grunn av begrensningene av makrofager. Nøkkel eksperimenter kan kreve alveolære makrofager for validering.
Foruten den her beskrevne protokoll fra ultrasentrifugering for å rense OMVS, er det mulig å utføre en tetthetsgradient sentrifugering, som er inkludert i protokollen ved Chutkan et al. 30. Dette kan forbedre renheten av det oppnådde OMV fremstillingen og redusere mengden av ko-renset proteinaggregater, flagellin, og LPS. Renheten av det oppnådde OMV preparat kan bli analysert ved transmisjonselektronmikroskopi eller ved nanopartikkel sporing analyse som et tilleggstrinn i kvalitetskontroll. Dette kan gi en ekstra midler for kvantifisering, utover protein måling prosedyren som presenteres her. Eventuelt kan LPS-konsentrasjonen bli analysert av en Limulus amebocyttlysat test. Hvis OMV utbyttet er lavt, enytterligere konsentrasjonstrinn via sentrifugalkreftene filtre kunne utføres, noe som ikke ble gjort her. Dersom utbyttet var lavere enn forventet, ble OMVS forkastet.
Som en del av den pågående arbeidet med å belyse biologiske mekanismer og funksjoner bak OMVS, kan påvirkning av ulike stressforhold på OMV produksjon testes. Nutrient deprivasjon, kan endringer i rugetemperatur, eller eksponering for skadelige stoffer har en innvirkning på OMV sekresjon 31. Mulige spenningsforholdene er omtalt i protokollen ved Klimentova og Stulik 32. Videre kan hyper- eller hypovesiculating L. pneumophila mutanter bli generert. De forskjellige OMV preparatene kan deretter bli analysert i smitteforsøk med makrofager, eksplanter humane lungevevet (som beskrevet i referanse 17), eller til og med i in vivo-modeller. I tillegg til rollen som OMVS i medfødte immunsignalisering, deres innflytelse i bakteriell kommunikasjonkan rettes eksperimentelt. Videre kan effekten av ulike medfødte immunsignalkaskader bli analysert ved anvendelse av murine knockout-celler eller genereringen av CRISPR / Cas9 svekninger i humane cellelinjer. Denne grunnleggende forskning i OMVS vil bistå i utviklingen av nye vaksinestrategier, som allerede finnes for hjernehinnebetennelse B overført av Neisseria meningitidis 33.
Med start fra den protokollen på OMV isolering og karakterisering, kan man anvende dette for andre Gram-negative bakterier og andre vertsceller; den bare trenger å bli justert til veksten av bakterier i flytende kultur. Protokollen publisert av Chutkan et al. gir detaljert informasjon om generering av OMVS fra Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa 30. Kulturen bør ikke nå sen stasjonær fase for å unngå økning i lyserte bakterier og forurensende proteiner og membraner. I tillegg er OMV dosen som brukes for stimulering av vertscellene må bestemmes i henhold til mengden av OMVS tilstede under in vivo-infeksjoner, samtidig som det sikrer en lav hastighet på cytotoksisitet. På denne måten, den patologiske rolle OMVS, deres innvirkning på inter-arter kommunikasjon, og vert-patogen interaksjoner kan undersøkes.
For ytterligere å studere rollen til L. pneumophila OMVS i lungebetennelse, er standardiserte OMV preparater med tilstrekkelig kapasitet og sammenlignbare smitteforsøk nødvendig. Denne protokollen vil bidra til å standardisere isoleringsprosedyrer og for å utvide OMV studier med andre Gram-negative bakterier og andre vertsceller. Videre vil forskning ha nytte av den detaljerte in vitro kunnskap, som kan brukes til å forlenge eksperimenter til in vivo-innstillinger. I fremtiden kan denne protokollen bli utvidet til isolering av OMVS fra primær biologisk materiale, slik som serum eller bronchoalveolar Lavalder væske, for å få innsikt i sammensetningen av OMVS utgitt under fysiologiske forhold. Dette vil bidra til å avgjøre viktige parametre for OMV sammensetning og å forstå egenskapene til in vitro dannede OMVS.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Dr. Markus Schnare for å gi oss med TLR2 – / – og TLR2 / 4 – / – mus og Prof. Dr. Carsten Kirschning for TRIF / MyD88 – / – mus. Deler av dette arbeidet ble finansiert av Bundesministerium für Bildung und Forschung (e: bio miRSys – FKZ 0316175B, e: Med CAPSYS – FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), og Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medisinsk RNomics – FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), alt til BS.
10 cm petridish | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 82.1473 | |
70 Ti rotor | Beckman Coulter Incorporation (California, USA) | 337922 | |
ACES | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9138.2 | |
activated charcoal | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | X865.2 | |
agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5210.2 | |
Columbia agar with 5 % sheep blood | Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | 254005 | |
cuvettes | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 67.742 | |
ELISA (human) | BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany) | IL-8: 555244 IL-6: 550799 | |
ELISA (murine) | DuoSet, R&D (Minneapolis, USA) | CXCL1: DY453-05 | |
Fe(NO3)3x9H2O | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 5632.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 10270-106 | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 40830469 | |
Heraeus Multifuge X3R | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 75004515 | |
Inoculation loop | Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany) | 86.1567.010 | |
KOH | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 6751.1 | |
L. pneumophila Corby | — | — | kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany) |
L. pneumophila Corby ΔflaA | — | — | kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany) |
L-cystein | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | ||
mBMDM | — | — | kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany) |
PBS | Biochrom GmbH (Berlin, Germany) | L 1825 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | P8139-1MG | |
rotating shaker (MaxQ 6000) | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | SHKE6000 | |
RPMI 1640 high glucose | Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany) | 11875-093 | |
saponin | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 9622.1 | |
Ultrospec 10 | Biochrom Ltd (Cambridge, England) | 80-2116-30 | |
sterile filter (pore size: 0.22 µm) | Corning Incorporated (new York, USA) | 431096 | |
THP-1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany) | 88081201-1VL | |
Sorvall Discovery 100 SE | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | ||
yeast extract | Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany) | 2363.2 | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany) | 23225 |