प्रयोगशाला पैमाने पर उत्पादन और एक चिकित्सीय एंटीबॉडी की शुद्धि
Summary
इस प्रोटोकॉल एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी के उत्पादन का वर्णन है। वर्णित विधियों वेक्टर डीएनए, स्थिर अभिकर्मक और एक मानव भ्रूण गुर्दे 293 सेल लाइन के सीरम मुक्त अनुकूलन की तैयारी, बड़े पैमाने पर संस्कृतियों और शुद्धि आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर की स्थापना शामिल हैं।
Abstract
Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.
Introduction
चिकित्सकीय एंटीबॉडी की सफलता एंटीबॉडी विकास में पर्याप्त निवेश करने के लिए ड्राइव के रूप में अगली पीढ़ी के चिकित्सा विज्ञान की एक लहर शुरू होता है जारी है। एंटीबॉडी बाजार अनुकूल गुणों के साथ 4 एंटीबॉडी टुकड़े 1, एंटीबॉडी दवा conjugates 2, bispecific एंटीबॉडी 3 और इंजीनियर एंटीबॉडी द्वारा reshaped होने की उम्मीद है। एक अन्य वर्ग दवा ब्याज प्राप्त biosimilars हैं। Biosimilar एंटीबॉडी 'अत्यधिक' समान एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी कि पहले से ही नियामक की मंजूरी प्राप्त हुआ है के उत्पादों को दोहराने कर रहे हैं। एक प्रस्तावित biosimilar इसकी संरचना, समारोह, पशु विषाक्तता, नैदानिक सुरक्षा और प्रभावशीलता, मानव फार्माकोकाइनेटिक्स (पी), फार्माकोडायनामिक्स (पीडी) और प्रतिरक्षाजनकता 5, 6 के लिए सम्मान के साथ प्रवर्तक एंटीबॉडी के साथ तुलनीय होना चाहिए।
अनुमोदन rbiosimilar एंटीबॉडी के Ates उत्पाद की अंतिम गुणवत्ता पर सख्त कमी के कारण धीमी गति से किया गया है। इस तरह के विशेष सेल लाइनों और संवर्धन की स्थिति अंतिम प्रसंस्करण कदम के माध्यम के रूप में सटीक विनिर्माण प्रक्रियाओं मालिकाना रह सकते हैं। क्या अधिक है, एंटीबॉडी के निर्माण स्वाभाविक है जो एक अत्यधिक इसी तरह के उत्पाद तैयार करने की चुनौती को जोड़ सकते हैं परिवर्तनशीलता के एक डिग्री शामिल है। एक व्यापक physiochemical और biophysical लक्षण और तुलना काफी मुश्किल है, फिर भी biosimilar एंटीबॉडी की विशेषताओं का प्रदर्शन अध्ययन का एक नंबर साहित्य 7, 8, 9 में उभर रहे हैं।
एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी पैदा करने के लिए संबंधित एंटीबॉडी जीन ले जाने के लिए एक वेक्टर के साथ स्तनधारी मेजबान कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ शुरू होता है। वेक्टर डिजाइन, सेल लाइन और संस्कृति की स्थिति पूर्व की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैंअभिव्यक्ति प्रणाली।
एंटीबॉडी के डीएनए दृश्यों ड्रग बैंक (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) या पेटेंट सहित अनुसंधान प्रकाशनों से sourced किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, त्रास्तुज़ुमाब के अनुक्रम ड्रग बैंक (: DB00072 डीबी आईडी) के माध्यम से उपलब्ध है। चर क्षेत्रों के अमीनो एसिड अनुक्रम वांछित मेजबान प्रजातियों में संश्लेषण के लिए जीन डिजाइन और अनुकूलन गुजरना कर सकते हैं। यह एक biosimilar एंटीबॉडी कि कोई संशोधन अमीनो एसिड अनुक्रम करने के लिए बनाया गया है के लिए महत्वपूर्ण है। एक बार जब संश्लेषित, एंटीबॉडी जीन पसंद का उचित वेक्टर में subcloned जा सकता है।
मानव आईजीजी दो समान भारी चेन और दो समान प्रकाश जंजीरों से मिलकर बनता है। दोनों श्रृंखलाओं में से कसकर विनियमित अभिव्यक्ति स्तनधारी कोशिकाओं 10 में heterologous आईजीजी प्रोटीन का इष्टतम उत्पादन के लिए आवश्यक है। अंतर के साथ ही अंतर-श्रृंखला डाइसल्फ़ाइड बांड का गठन किया जाना है और बाद translational संशोधनों की संख्या में रहना होगाप्रोटीन जैवसंश्लेषण के दौरान पेश। वैक्टर के एक संख्या है कि विशेष रूप से करने के लिए एंटीबॉडी जीन (सामग्री की तालिका देखें) एक्सप्रेस डिजाइन किया गया है उपलब्ध हैं। ये एंटीबॉडी विशिष्ट वैक्टर आमतौर पर निरंतर क्षेत्रों दोनों भारी और प्रकाश श्रृंखला के लिए इतना ही प्रत्येक श्रृंखला का अस्थिर क्षेत्रों क्लोनिंग की आवश्यकता व्यक्त करते हैं।
दो स्वतंत्र निर्माणों (सह अभिकर्मक) के साथ कोशिकाओं के अभिकर्मक भारी और प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग जीन पहुंचाने के लिए सबसे आम तरीका है। यही है, प्रत्येक जीन जालिका में इकट्ठा किया जा रहा से पहले अपने स्वयं के प्रमोटर द्वारा संचालित और अलग एंटीबॉडी श्रृंखला के रूप में लिखित है। दूसरी ओर, बहु cistronic वैक्टर आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइट (IRES) कि mRNA 11 के आंतरिक क्षेत्रों से अनुमत अनुवाद के साथ एक एकल mRNA प्रतिलेख के रूप में कई जीनों की अभिव्यक्ति की अनुमति शामिल तत्वों है। इस उदाहरण में, भारी और प्रकाश श्रृंखला एन्कोडिंग जीन एक arrang में मिलकर कर रहे हैंदोनों एंटीबॉडी चेन 10, 12 के सह-अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के ement।
क्षणिक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पर्याप्त प्रोटीन उपज जबकि प्रयोगों की एक सीमित संख्या में प्रदर्शन करने के लिए, स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों है कि जीनोम एकीकरण के लिए चयन आया है अधिक पैदावार दे सकते हैं। उच्च प्रोटीन की मात्रा में इन विट्रो लक्षण वर्णन करने के लिए संबंधित परख विकास के लिए अनुमति देते हैं और इस तरह के प्रतिरूप सेल लाइन और नेतृत्व उम्मीदवार चयन के रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए विचार में एंटीबॉडी गुणवत्ता का एक संकेत प्रदान कर सकते हैं।
इस अनुच्छेद के लक्ष्य स्थिर अभिव्यक्ति और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी एक स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित की शुद्धि का वर्णन है। दरअसल, इस पद्धति का एक biosimilar एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति के लिए लागू किया जा सकता है। विधि महत्वपूर्ण है पर आगे बढ़ने से, यद्यपि समय लेने वाली काएं से पहले एंटीबॉडी के प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकताबड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक वांछनीय क्लोन की पहचान के पी एस। इसके अलावा, इस विधि अन्य प्रोटीन और न सिर्फ एंटीबॉडी व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
निम्नलिखित विस्तृत प्रोटोकॉल चिकित्सीय एंटीबॉडी त्रास्तुज़ुमाब की अभिव्यक्ति का वर्णन है। इस वेक्टर डीएनए एक स्वचालित chromatographic विधि द्वारा HEK-293 सेल लाइन और एंटीबॉडी प्रोटीन की शुद्धि में स्थिर अभिकर्मक के बाद की तैयारी के होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल HEK 293 कोशिकाओं में अभिकर्मक स्थिर, अभिव्यक्ति और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी की शुद्धि का विवरण। एंटीबॉडी जीनों की अभिव्यक्ति स्थिर विकास और एक चिकित्सकीय एंटीबॉडी के निर्माण के लिए एक एंटीबॉ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.
Materials
| pFUSE vector series | N/A | InvivoGen | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. |
| mAbXpress vector series | N/A | ACYTE Biotech Pty Ltd. | Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010). |
| pVITRO1 vector | N/A | N/A | Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector. Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014). |
| GS vector series | N/A | Lonza | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. |
| Multi-cistronic vector series 1 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007). |
| Multi-cistronic vector series 2 | N/A | N/A | Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012). |
| pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ | 61883 | Addgene | Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ was a gift from Andrew Beavil. |
| Fast-Media Hygro Agar | fas-hg-s | Jomar Life Research | Used to prepare low salt LB agar containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Fast-Media Hygro TB | fas-hg-l | Jomar Life Research | Used to prepare low salt TB broth containing 75 µg/ml hygromycin. |
| Glycerol, BioXtra, ≥99% | G6279 | Sigma-Aldrich | Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature. |
| Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit | G221020 | Astral Scientific | Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5). |
| FreeStyle 293-F Cells | R790-07 | Life Technologies | HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media. |
| FreeStyle 293 Expression Medium | 12338-018 | Life Technologies | Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression. |
| Kolliphor P188 | K4894 | Sigma-Aldrich | Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| DMEM, high glucose | 11995-065 | Life Technologies | |
| Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum | 10082-147 | Life Technologies | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000 | 23966 | Polysciences, Inc. | Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at -80oC until use. |
| OptiPro SFM | 12309-050 | Life Technologies | Transfection formulated serum-free media |
| Hygromycin B Solution | ant-hg-1 | Jomar Life Research | |
| Dimethylsulphoxide (DMSO) | AJA2225 | Thermo Fisher Scientific | |
| Tryptone (casein peptone) | LP0042B | Thermo Fisher Scientific | Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 μm filter. Store at 4oC. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml | 09-2051-100 | Astral Scientific | |
| HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column | GE17-0403-01 | Sigma-Aldrich | |
| AKTApurifier 100 | 28406266 | GE Healthcare | Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector. |
| Glycine-HCl | G2879 | Sigma-Aldrich | |
| Citric Acid, monohydrate | BIOC2123 | Astral Scientific | |
| Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate | BIOCB0035 | Astral Scientific | |
| 1 M Tris-HCl solution pH 9.0 | BIOSD8146 | Astral Scientific | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO) | UFC803008/UFC903008 | Merck Millipore | Used to buffer exchange and concentrate purified protein. |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher Scientific | |
| BLItz System | 45-5000 | fortéBIO | Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements. |
| Protein A biosensors | 18-5010 | fortéBIO | |
| Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution | 786-502 | Astral Scientific | |
| Ammonium Persulfate (APS) | AM0486 | Astral Scientific | |
| TEMED | AM0761 | Astral Scientific | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | 786-498 | Astral Scientific | |
| Precision Plus Dual-Color Protein Standard | 1610374 | Bio-Rad |
Riferimenti
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