लाइव कोंफोकल इमेजिंग विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ जीव प्रदान करता है। यहाँ, हम Arabidopsis फूल विकसित करने की लाइव कोंफोकल इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
पौधों की वृद्धि और विकास के अध्ययन में लंबे समय मृत, तय ऊतकों का उपयोग कर और उचित सेलुलर संकल्प की कमी प्रयोगात्मक तकनीक पर भरोसा किया गया है। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों, कई fluorophores के विकास के साथ संयुक्त, इन मुद्दों पर काबू पाने और संभावना, एक अच्छा सेलुलर संकल्प के साथ, लाइव नमूनों में एक साथ कई जीनों की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के खोल लिया है। लाइव कोंफोकल इमेजिंग विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ संयंत्र जीव प्रदान करता है, और बड़े पैमाने पर जड़ के विकास और शूटिंग के शीर्षस्थ विभज्योतक के किनारों पर पार्श्व अंगों के गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, यह व्यापक रूप से फूल के विकास के अध्ययन के लिए, चुनौतियों है कि इस तरह बाह्यदल कि फूल विभज्योतक के साथ बढ़ती के रूप में फूल, इमेजिंग, और अंतर्निहित ऊतकों से प्रतिदीप्ति को फ़िल्टर करने के लिए विशिष्ट हैं के कारण लागू हिस्से में नहीं किया गया है। यहाँ, हम लाइव पर लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए, अरब के विकास में एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेशidopsis फूलों की कलियों, या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर।
या शिखर मेरिस्टेमों – – गोली मारता है और जड़ों के संयंत्र शरीर के अधिकांश स्टेम पर या टिप के पास स्थित कोशिकाओं के समूहों से रूपों के बाद embryonically। फूल मेरिस्टेमों (एफएमएस) के बाद यह प्रजनन चरण के लिए संक्रमण वनस्पति चरण के दौरान छोड़ देता है, और: सभी वयस्क संयंत्र की जमीन के ऊपर संरचनाओं गोली मार शीर्षस्थ विभज्योतक (एसएएम), जो लगातार अपने किनारों पर पार्श्व अंगों का उत्पादन से निकाले जाते हैं। बदले में एफएमएस फूल के रूप में विकसित। जबकि Arabidopsis सैम एक समय में पार्श्व अंगों एक पैदा करता है, एक सतत, सर्पिल पैटर्न में, एफएमएस चार whorls भीतर पुष्प अंगों के चार प्रकार, उत्पादन, एक आंशिक रूप से तुल्यकालिक ढंग से कई विकासात्मक कार्यक्रमों को एक साथ उजागर साथ। विभिन्न पुष्प अंगों की पहचान के विनिर्देश अंतर्निहित आनुवंशिक नेटवर्क आंशिक रूप से सही मतलब निकाला गया है, लेकिन कई पहलुओं फूल विकास सेमिनारों की (समीक्षा के लिए, संदर्भ 1, 2 देखें)NT, इस तरह के फुलीय अंग स्थिति और whorls के बीच की सीमाओं की परिभाषा के रूप में, खराब समझ रहते हैं।
संयंत्र के विकास के प्रारंभिक आणविक आनुवंशिक अध्ययन का ज्यादातर उपयोग, स्वस्थानी संकरण और गस संवाददाताओं से जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने में के रूप में तकनीक पर भरोसा किया। एक ही में कई जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न की आसान अवलोकन के लिए अनुमति नहीं देते वे अच्छे सेलुलर संकल्प की कमी है,: इन तरीकों जानकारी का खजाना प्रदान की है और बहुत पौधों की वृद्धि और फूल विकास की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है, वहीं महत्वपूर्ण सीमाएं हैं नमूने, और महत्वपूर्ण बात, केवल मृत, तय ऊतकों को लागू किया जा सकता। कोंफोकल माइक्रोस्कोपी में हाल के अग्रिमों इन सीमाओं को पार, और प्रक्रियाओं अंतर्निहित संयंत्र morphogenesis की जांच के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के साथ विकासात्मक जीव प्रदान किया है। विशेष रूप से, कोंफोकल माइक्रोस्कोपी लाइव ऊतकों और अंगों उनके निर्माण के दौरान के अवलोकन, जो सी है के लिए अनुमति देतापूरी तरह से इस तरह के विकास के रूप में एक सर्वोत्कृष्ट गतिशील प्रक्रिया को समझने में ritical।
लाइव कोंफोकल इमेजिंग बड़े पैमाने पर, (उदाहरण के लिए संदर्भ 7, 8 (जैसे 3 का संदर्भ है, 4, 5, 6), लेकिन कुछ रिपोर्टों के अपवाद के साथ सैम द्वारा पौधों की हवाई विकास और पार्श्व अंगों के उत्पादन विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है 9, 10), यह व्यापक रूप फूल के विकास के अध्ययन के लिए लागू नहीं किया गया है। सैम की लाइव कोंफोकल इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं (उदाहरण के लिए 11 का संदर्भ है, 12), और कैसे छवि के लिए विकासशील फूलों की कलियों कि सैम के चारों ओर के लिए एक अच्छा आधार प्रदान करते हैं। हालांकि, इमेजिंग फूलों की कलियों विशिष्ट चुनौतियों प्रस्तुत करता है: उदाहरण के लिए,फूलों की कलियों जल्दी से सैम से भी बड़ा हो गया है, और चरण 4 में, बाह्यदल (संदर्भ 13 में वर्णित के रूप चरणों) एफएम को कवर, और ऊतकों (चित्रा 2A) अंतर्निहित से प्रतिदीप्ति मंद शुरू करते हैं। यहाँ, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल बताया गया हो कि या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप और एक पानी में डुबकी लेंस का उपयोग Arabidopsis फूलों की कलियों के विकास पर लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए प्रदान करते हैं। हम पहले से संदर्भ 14 में इस प्रोटोकॉल को प्रकाशित किया।
यहाँ, हम एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप और एक पानी में डुबकी लेंस के साथ लाइव, विकासशील Arabidopsis फूलों की कलियों की इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह या तो एक ईमानदार या उलटे माइक्रोस्कोप के साथ किया जा सकता है, यह आसान और तेज पूर्व उपयोग करने के लिए है। यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि विभिन्न कोंफोकल सिस्टम गति, संवेदनशीलता, और क्षमता अलग तरंग दैर्ध्य के लिए के मामले में काफी भिन्नता है लायक है। एक ही नमूनों में, सबसे अच्छा कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी अब छवि कई अलग अलग चैनलों (चित्रा 2 जी जैसे GFP, YFP, dsRed और propidium आयोडाइड) करने के लिए अनुमति देते हैं। कुछ कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर, जो एक साथ कई fluorophores से प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने और उन्हें बाद में अलग कर सकते हैं के साथ सुसज्जित हैं। एक नियमित रूप से डिटेक्टर का उपयोग करते समय, तथापि, लेज़रों और फिल्टर का एक सेट को उत्तेजित और विभिन्न fluorophores से प्रतिदीप्ति अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। कुछ fluorophores पूरी तरह से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा है (उदाहरण के लिए सीएफपी एकघ YFP), और साथ ही साथ imaged किया जा सकता है। अन्य fluorophores आंशिक रूप से अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (जैसे GFP और YFP) है, और आमतौर पर जो इमेजिंग समय बढ़ जाती है अलग से imaged किया जाना है, जरूरत है। करीब fluorophores इमेजिंग भी अक्सर सीमित प्रत्येक चैनल एक और चैनल में लीक से एक फ्लोरोफोरे से प्रतिदीप्ति को रोकने के लिए के लिए एकत्र किया जाता है कैसे स्पेक्ट्रम की बहुत आवश्यकता है। यह एकत्र संकेत है, जो लेजर शक्ति और लाभ में वृद्धि से मुआवजा दिया जा सकता है की तीव्रता का एक नुकसान का कारण बनता। हालांकि, लंबे समय तक इमेजिंग समय और वृद्धि की लेजर शक्ति ब्लीच और / या नमूना नुकसान हो सकता है। बढ़ी हुई लेजर शक्ति और / या लाभ भी पृष्ठभूमि शोर बढ़ सकता है। संकेत तीव्रता, संकल्प और प्रत्येक नमूने के लिए इमेजिंग समय का अनुकूलन एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से किया, और स्थायी व्यापार गत शामिल है।
यह प्रोटोकॉल कैसे एक विच्छेदित शूट एपेक्स के किनारों पर विकसित फूलों की कलियों का लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए बताते हैं। यहतर्क दिया जा सकता है कि तथ्य यह है कि शूट एपेक्स संयंत्र के बाकी हिस्सों से जुड़ा नहीं है और एक मध्यम cytokinins सैम और फूल विकास को प्रभावित कर सकता युक्त में होती है। हालांकि, इस माध्यम विच्छेदित शूटिंग सुनिश्चित करने के लिए शिखर मेरिस्टेमों सामान्य plastochron पर नए फूलों की कलियों का उत्पादन है, और है कि इन फूलों की कलियों सामान्य रूप से 15 का विकास एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया के माध्यम से अनुभव डिजाइन किया गया था। इसी तरह, बाह्यदल विच्छेदन जीन अभिव्यक्ति पैटर्न या फूल के बाकी के विकास को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता। अन्य प्रोटोकॉल विस्तार सैम की लाइव कोंफोकल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए अभी भी संयंत्र के बाकी के साथ संलग्न (जैसे संदर्भ 11)। ऐसे प्रोटोकॉल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और फूलों के विकास, खासकर जब साइटोकिनिन से संबंधित प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की इमेजिंग के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करते हैं। वे कई नुकसान पेश तथापि: स्टेम elongates और ट्विस्ट, और फूलों की कलियों के उन्मुखीकरण परिवर्तन, एnd जबकि इमेजिंग एक शूट एपेक्स संयंत्र के बाकी से जुड़ी एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ अच्छी तरह से काम करता है, यह एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ ऐसा करने के लिए और अधिक जटिल है।
विसर्जन लेंस एक बेहतर संख्यात्मक एपर्चर (एनए) की तुलना में "सूखी" लेंस (यानी लेंस है कि हवा से नमूना से अलग होती है), और इसलिए नमूना है, जो महत्वपूर्ण है जब एक कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करने का एक बेहतर संकल्प प्रदान करते हैं। एक पानी में डुबकी लेंस का प्रयोग इस प्रकार, जबकि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान निर्जलित प्रक्रिया से शूट एपेक्स को रोकने, एक सूखी लेंस की तुलना में काफी बेहतर एनए प्रदान करता है। जबकि ग्लिसरीन और तेल लेंस पानी लेंस की तुलना में भी अधिक एनए है, वे एक coverslip, जो एक नमूना एक शूट एपेक्स, जो भी समय-अंतराल प्रयोगों के दौरान बढ़ रही रखता है के आकार के साथ बहुत अव्यावहारिक है के उपयोग की आवश्यकता। नमूनों की आकार को देखते हुए (पुष्प चरणों के आधार पर, ढेर के ऊपर 150 सुक्ष्ममापी मोटी हो सकता है), यह भी महत्वपूर्ण है कि एक लंबे समय तक काम दूरी के साथ एक लेंस का उपयोग करने के। हम आम तौर पर 1 के एक एनए और 1.7-2.5 मिमी काम कर रहे दूरी के साथ एक 20 या 40X लेंस का उपयोग करें।
कोंफोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर कोंफोकल डेटा कल्पना करने के लिए कई तरीके, तीन आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा 2, बी 1, बी 2 और बी 4) और टुकड़ा देखा गया (चित्रा 2, बी 3) सहित प्रदान करता है। जबकि सबसे अधिक इस्तेमाल किया तीन आयामी विचारों कोंफोकल जेड के ढेर (चित्रा 2, बी 1 और बी 4), कुछ सॉफ्टवेयर की अधिकतम तीव्रता अनुमानों हैं (उदाहरण के लिए ज़ेन और Imaris) भी पारदर्शिता दृश्य पेश करते हैं कि के गहरे भागों से संकेत बाहर फिल्टर नमूना (चित्रा 2, बी 2) है, जो उपयोगी है जब जगह लेने की प्रक्रिया, या जीन में, एपिडर्मल परत व्यक्त को देखकर हो सकता है। संकेत तीव्रता या तो, एक ही रंग (चित्रा 2, बी 1) के साथ कोडित किया जा सकता है पिक्सेल बौद्धिक अत्याधुनिक का उपयोग करnsity, या एक रंग कोड (चित्रा 2, बी 4) का उपयोग कर।
लाइव कोंफोकल इमेजिंग न केवल फूल विकास में बहुमूल्य गुणात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह भी संभावित विकास जीव मात्रात्मक डेटा का खजाना के साथ प्रदान करता है। विभिन्न सॉफ्टवेयर (जैसे Imaris, फिजी, मंगल ग्रह एएलटी, MorphographX 15, 20, 21) नंबर या एक या कई पत्रकारों, या विभिन्न कोशिकाओं में एक पत्रकार की अभिव्यक्ति के स्तर व्यक्त कोशिकाओं की मात्रा का परिमाणन लिए अनुमति देता है। ऐसे सॉफ्टवेयर भी, स्वत: सेल विभाजन प्रदर्शन कोशिका वंश पर नज़र रखने और विकास यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह विभिन्न सॉफ्टवेयर समान उपकरण प्रदान करता है, लेकिन यह भी कई मायनों में अलग है। मंगल ग्रह एएलटी और MorphoGraphX Imaris एक के विपरीत, पौधों 15, 20, 21 के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए थेnd फिजी। MorphoGraphX केवल, विभाजन और एपिडर्मल परत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जबकि Imaris और मंगल-एएलटी विभाजन और पूरे नमूना के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, मंगल ग्रह एएलटी तीन विभिन्न कोणों 15 से ही नमूना की पूर्व इमेजिंग की आवश्यकता होती है, और Imaris केवल एक ही ढेर की आवश्यकता है। मात्रात्मक जानकारी तक पहुंच फूल विकास की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपने समर्थन के लिए प्रो इलिअट M मेयेरोविट्ज़ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और के साथ तकनीकी मुद्दों को सुलझाने में उनकी मदद के लिए कैलटेक में जैविक इमेजिंग सुविधा में पांडुलिपि पर टिप्पणी है, साथ ही डार्टमाउथ कॉलेज और डॉ एंड्रेस कोलाजो पर ऐन लावनवे लाइव कोंफोकल इमेजिंग। नाथानीअल प्रूनेट के काम अमेरिका के राष्ट्रीय इलिअट M मेयेरोविट्ज़ को अनुदान R01 GM104244 के माध्यम से स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा समर्थित है।
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |