Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
Replicatie van het genoom plaatsvindt tijdens de S fase van de celcyclus in een sterk gereguleerd proces dat de getrouwheid van DNA-duplicatie zorgt. Elk genomisch gebied wordt gerepliceerd op een specifieke tijd gedurende de S-fase door de gelijktijdige activering van verschillende oorsprongen van replicatie. Tijd van replicatie (ToR) correleert met vele genoom en epigenetische kenmerken en is gekoppeld aan mutatie tarieven en kanker. Het begrijpen van de volledige genomische uitzicht op de replicatie-programma, in gezondheid en ziekte is een belangrijke toekomstige doel en uitdaging.
Dit artikel beschrijft in detail de "Copy Number Verhouding S / G1 voor het in kaart brengen van genomische Time of Replication" methode (hierin genoemd: CNR-ToR), een eenvoudige benadering van de genoomwijde ToR van zoogdiercellen kaart te brengen. De werkwijze is gebaseerd op het kopienummer verschillen tussen de S-fase cellen en G1-fase cellen. De CNR-ToR werkwijze wordt uitgevoerd in 6 stappen: 1. Bereiding van cellen en kleuring met propidiumjodide (PI); 2. Sorting G1 en S-fase cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS); 3. DNA-zuivering; 4. Sonicatie; 5. voorbereiding en sequencing Bibliotheek; en 6. Bioinformatica analyse. De CNR-ToR methode is een snelle en eenvoudige aanpak die resulteert in gedetailleerde replicatie kaarten.
Introduction
Zoogdier DNA replicatie strak geregeld om de juiste replicatie van elk chromosoom precies één keer te verzekeren tijdens de celcyclus. Replicatie gebeurt op basis van een sterk gereguleerde order – meerdere grote genomische regio's (~ Mb) te herhalen aan het begin van de S-fase (begin repliceren domeinen), terwijl andere genomische regio's later bootsen midden of late S-fase (midden en late replicerende domeinen) 1. De meeste genoom repliceert tegelijk in alle weefsels (constitutieve ToR domeinen), terwijl 30% – 50% van het genoom verandert ToR tussen weefsels 2, tijdens differentiatie 3, 4 en in mindere mate ook bij kanker transformatie 5 . Bovendien bepaalde genoomgebieden repliceren asynchroon 6, 7, 8, namelijk er is een verschilin de ToR tussen de twee allelen.
ToR correleert met vele genomische en epigenomisch functies, waaronder transcriptie niveaus, GC-gehalte, chromatine staat, gen dichtheid, enz. 1, 9. ToR wordt ook geassocieerd met mutatie tarieven en types 10, 11 en daarom niet verwonderlijk, worden verstoringen van de replicatie-programma verband gebracht met kanker 12, 13. Het causale verband tussen de taakomschrijving en chromatine structuur is nog niet begrepen. Het is mogelijk dat geopend chromatine vergemakkelijkt vroege replicatie. Echter, een alternatief model suggereert dat het chromatine gemonteerd tijdens de replicatie en de verschillende chromatine regulatoren bij het begin en het einde van S-fase leidt tot differentiële verpakking van vroeg en laat replicerende gebieden 1, 14 </sup>. We hebben onlangs aangetoond dat de ToR geeft vorm aan de GC-gehalte van invloed zijn op de aard van de mutaties die zich voordoen in verschillende genomische regio's 11.
Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is de belangrijkste methode voor het meten ToR op individueel loci. Het is eenvoudig uitgevoerd door het tellen van het percentage S-fase cellen die één FISH signalen versus percentage doubletten voor een bepaald allel 15, 16 vertonen. Een alternatieve methode bestaat uit het labelen van de puls DNA met BrdU, sorteren van cellen op basis van hun DNA inhoud aan verschillende tijdstippen langs S, immunoprecipitatie DNA met BrdU en controleren van de overvloed aan DNA neergeslagen met 17 qPCR.
Genomische ToR mapping kan worden bereikt op twee manieren. De eerste methode is een genomische versie van de BrdU-IP hierboven beschreven, waarin de kwantificering van de hoeveelheidvan geprecipiteerd DNA in elke fractie gelijktijdig uitgevoerd voor het volledige genoom tot hybridisatie aan microarrays of diepe sequencing. De tweede methode, CNR-referentiekader, is gebaseerd op het meten van het aantal kopieën van elk genomisch gebied van S-fase cellen en het normaliseren van het DNA-gehalte in G1 cellen. Bij deze werkwijze worden de cellen gesorteerd door FACS in niet-replicerende (G1-fase) en repliceren (S-fase) groepen (Figuur 1). Cellen in G1 hetzelfde aantal kopieën in alle genomische regio en zullen hun DNA inhoud hetzelfde zijn. Anderzijds, het DNA kopieaantal in S afhankelijk van het referentiekader, sinds begin replicerende regio onderging replicatie in de meeste cellen en dus hun DNA-inhoud wordt verdubbeld, terwijl laat replicerende gebieden nog in de meeste cellen gerepliceerd en dus hun DNA inhoud analoog is aan die van G1 cellen. Vandaar de S om G1-verhouding van DNA-gehalte is een indicatie van het mandaat. De hoeveelheid DNA per genomisch gebied wordt gemeten door hybridisatie metmicroarrays of door diepe sequencing 2, 8. De voordelen van het CNR-ToR methode zal verder worden besproken.
Dit document beschrijft de CNR-Tor methode voor het genoom ToR in kaart brengen, zoals beschreven in figuur 2. Het artikel bespreekt de fijne details van het gehele proces van het verzamelen van de cellen tot de fundamentele analyse van de resultaten en het creëren van genomische ToR kaarten. De in dit document beschreven protocol is met succes uitgevoerd op verschillende celtypen in kweek. Toekomstige verbeteringen van dit protocol kan leiden tot het in kaart brengen van het referentiekader in vivo en in zeldzame celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-ToR kan uitgevoerd worden in principe op elke eukaryote prolifererende celpopulatie die kunnen worden gedeeld door FACS op S en G1 fasen (beoordeeld door Rhind N. en Gilbert 20 DM). De hier beschreven methode is aangepast voor zoogdiercellen met een genoomgrootte van ~ 3 Gb zoals mens en muis. Kleine veranderingen in de CNR-ToR protocol (in celpreparaat en sequentiebepaling diepte) nodig, om aan te passen aan andere eukaryoten. Aandacht moet worden besteed aan het verzamelen van voldoende hoe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Oriya Vardi voor hulp bij het genereren van cijfers. Werk in de IS-groep werd gesteund door de Israel Science Foundation (subsidie No. 567/10) en de European Research Council Starting Grant (# 281306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
Riferimenti
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
