포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :<em> 체외</em> 분석 낭포 성 섬유증 환자의 약물 반응을 평가하기위한
Summary
This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.
Abstract
Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 °C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.
Introduction
CF는 상피 음이온 채널을 암호화하는 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도도 조정기 (CFTR) 유전자의 돌연변이에 의해 발생합니다. CF는 전 세계적으로 1 약 85,000명에 영향을 미친다. 2,000 CFTR 돌연변이는 (확인되었다 www.genet.sickkids.on.ca ). 이러한 다양성은 부분적으로 관찰 질환 표현형 (넓은 스펙트럼을 설명 www.CFTR2.org ) 2, 3. CFTR 돌연변이 여섯 클래스 CFTR 단백질 발현과 기능에 미치는 영향에 기초하여 정의된다 : (I)없이 합성 (II) 손상 피킹 (III) 불량 채널 게이팅 (IV)가 변경 컨덕턴스 (V하면) 보통의 수준을 감소 CFTR를 작동하고 (VI) 손상된 세포 표면 안정성 4. 일반적인 CFTR 돌연변이가 잘 연구되어 있지만, CFTR 기능과 임상 적 상태와 관계 poorl 유지Y는 특히 드문 "고아"돌연변이 (의 큰 그룹에 대해 각 레벨에서 이해 www.CFTR2.org ) 1,3.
최근 약물 돌연변이 특정 방식으로 CFTR 단백질을 대상으로 개발되어왔다. CFTR 단백질 표적 약물의 두 클래스는 임상 현재 사용중인 액션의 독특한 모드가 있습니다. 이러한 VX-770과 같은 강화제는 치근단 지역화 돌연변이 CFTR의 개방 가능성을 향상시키고 세포 5에 자신의 추가에 직접 작용한다. 이러한 VX-809과 같은 교정기는 소포체 지역화 잘못 폴딩의 CFTR의 인신 매매를 복원하고 효과 전에 세포가 6 관찰과 사전 배양이 필요합니다. CFTR의 강화제, VX-770과 같은 다른 팔에 관해서는, G551D 돌연변이 7,8 피험자에 등록되었습니다CFTR은 S1251N (9)를 포함하여, 돌연변이를 게이팅; 함께, 이러한 돌연변이는 모든 CF 과목의 5 %에 의해 수행된다. 다른 임상 시험, VX-770, 보의 VX-809과 결합이 폐 기능에 아직 심각한 영향을 제한 한 것으로 나타났다 환자 10 45-50%에 의해 전달되는 F508del 돌연변이에 대한 동형 접합을 대상으로 악화 속도의 감소가 발생했습니다 11.
CF 환자의 나머지 50 % 이내 약물 반응 주체를 식별하는 종래의 임상 비용과 시간을 소모하며, 매우 드문 CFTR 유전자형을 가진 개인 가능하지 않다. 신규 비용 효과적인 개인화 방법 CFTR 돌연변이 임의의 타입을 운반하는 개인 CFTR 조절제의 증가와 일치하는 것이 중요하다. 지금까지 특정 CFTR 돌연변이를 운반하는 환자 그룹의 시험 포함은 시간에 돌연변이 CFTR 유전자 형질 전환을 사용하여 연구에 의해 유도 된챔버들 (5, 6), (12)를 전기 생리 학적 연구에 Ussing 하였다 eterologous 전지 시스템. 때문에 CF 폐 이식편 재료로부터 유도 된 공기 – 액체 계면 분화 기관지 상피 세포에서의 CF 적절한 동물 모델 약물 효능 연구의 부족 약물 개발 13, 14, 15에 사용되었다. 그러나, 폐 절편 조직 및 침습적 제한된 가용성 흔하지 CFTR 돌연변이의 분석을 방해 말기 질환이없는 환자에서 기관지 세포를 수득하고, 개인화 된 방식으로 약물 검사를 방지 할 수있다. 이러한 제한 등 대장 organoids, 비강기도 세포와 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된기도 세포와 같은 "쉽게 접근"조직을 극복하기 위해, 현재 맞춤 약물 치료에 대한 탐구되고있다.
<p class= "jove_content"> 이전에, 우리는 3D organoids (16), (17)의 형태로 어떤 위장 기관에서 배양 상피 줄기 세포에 대한 프로토콜을 설립했다. 인간 대장 / 직장 들면, 배양 조건이 정의 된 것을 포함 성장 인자 (상피 성장 인자 (EGF), 가스트린,이 Wnt-3A, R-spondin 3 (Rspo3) 및 소량) 소분자 (니코틴 A83-01와 결합 지하실 막 매트릭스 및 SB202190). 이러한 조건에서, 하나의 줄기 세포 또는 소규모 조직 단편 바깥쪽으로 향한 기부 쪽 고도로 편광 된 상피 세포에 의해 형성된 폐쇄, 낭포, 3 차원 구조 속으로 성장한다. 모든 세포 유형은 일반적으로 정상 비율과 위치에 나타납니다. Organoids 주간 기계적 파괴 및 재 도금에 의해 장기간에 걸쳐 확장 될 수있다. 그들은 유전자 표현형과 안정하고 장기간 팽창 바이오 뱅킹 17 있도록 저장 될 수있다. 그들은 의무가 있습니다모든 표준 세포 생물 / 유전자 조작 및 분석 기술은 2D 셀 라인 (18)을 위해 개발.최근 CFTR 기능이 용이 포스 콜린 – 유도 부종 (FIS) 분석 19 (20) 대장 organoids 측정 할 수 있음을 보여 주었다. 콜레라 독소 대안 포스 콜린 (FSK) 또는에 노출되면 organoids 급속히 그들 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP) 수준을 증가되는 CFTR 채널 (19)의 개구부에 회전 결과이다. 건강한 사람에서, 또는 잔여 기능과 관련된 CFTR 돌연변이와 과목에서 Organoids는 이후 organoid 루멘, 분비 성 설사의 체외 상당 이온과 물 수송의 결과로 팽창 할 것이다. CFTR 널 개체로부터 유래 organoids으로 나타낸 바와 같이 대장 organoids FIS의 응답은 이전에 완전히 CFTR 의존적 도시 된특정 약리학 CFTR 억제제 (19)의 사용에 의해 찾지. 큰 주제 특정 데이터 세트는 조직 검사를 복용 후 몇 주 내에 유도 될 수있다.
여기에 상세하게 설명 FIS 분석의 경우, organoids는 나이와 제한된 불편 (21)를 얻을 수있다 직장 생검에서 배양한다. Organoids 쉽게 다시 봉인하고 새로운 organoids을 형성 한 지하실에 기계 중단으로 매주 계대 있습니다. FIS 분석을 실행하는 경우, ~이 중단 작은 organoids의 30 ~ 80은 96 웰 플레이트 (19)의 각 웰에 도금되어있다. 분석의 일에서, organoids는 칼 세인 녹색, 그것은 라이브 영상을 용이하게 살아있는 세포 내에서 유지되는 형광 세포 투과성 염료로 염색한다. 그런 다음, 세포 내 cAMP를 제기하여 CFTR을 활성화 FSK는 organoid 부종을 자극하기 위해 추가됩니다. 혀끝의 CFTR에 따라 행동 강화제를 동시에 w 추가포스 콜린 i 번째, CFTR 인신 매매를 복원 보정기 반면 FSK를 추가하기 전에 24 시간을 추가됩니다. organoid 붓기는 포스 콜린을 첨가 할 때마다 포인트에 대한 모든 형광 객체의 전체 면적의 상대적인 증가를 계산하는 자동화 된 이미지 분석에 의해 정량화한다.
3D는 붓기가 챔버 Ussing에서 2D 배양기도 세포에서 기존의 전기 생리 CFTR 판독을 통해 장점과 단점을 제공 organoid. 주요 장점은 부종 검정의 스루풋이다. 세포 배양 배지의 한 유형을 이용하여 분석하고, 숙련 된 기술자는 12 환자 샘플에서 주당 약 1,200 데이터 포인트를 배양 매주 25 organoid 샘플까지 정량화 할 수있다. 우리는 통상적으로 판 당 중복 또는 세중의 측정에 의해 하나의 실험 조건을 입력하고 3 개의 독립적 인 배양 시간 지점에서 이러한 측정을 반복합니다. 총, 약 300-500의화롯불 organoid 구조는 다음 제한 기술 변화와 CFTR 기능의 매우 정확한 측정에 리드 실험 조건에 따라 측정된다. 이 정밀도는 우리가 명확하게 CFTR 변조기에 잔류 기능 및 응답의 차이를 정의 할 수 있습니다 용이 동일 CFTR 돌연변이 19, 22, 23, 24, 25를 들고 환자 사이의 유전 적 배경 효과를 데리러 우리를 할 수 있습니다. 데이터 품질 용이 현미경 이미지에서 평가 될 수있다. FIS가 완전히 CFTR에 의존하지만,이 CFTR 기능에 대한 간접적 인 결과 측정, 유체 수송에 이온 수송의 결합에 의한 그 판독. 이 transepithelial 이온 전류 (26)를 측정 Ussing 실에서 직접 CFTR 기능 측정과 대조. Ussing 챔버 꼭대기 또는 기저 (c)의 선택 자극을 허용ompartments합니다 (organoid 분석이 허용하지 않는); 기저 막을 permeabilizing함으로써, 정점 CFTR 의존성 음이온 분비 선택적 (27)를 측정 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 인간의 대장 organoids의 생성, 확장, 냉동과 해동을위한 완벽한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 인간의 organoid 문화를 몇 시간 전에 17를 설립하지만, 때로는 교육 실습없이 다른 연구소에서 기술을 확립하기 어려운 입증했다. 우리는 이러한 프로토콜은 교육을 대체 할 것으로 예상.
이 Wnt-3A 에어컨 매체 수립하고 organoid 문화 장기적인 유지에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 네덜란드의 CF 재단 (NCFS), ZonMW (40-00812-98-14103)는 빌헬미나 아동 병원 연구 기금과 CZ, 및 Zilverenkruis / Achmea의 HIT-CF 프로그램에 의해 지원되었다. 우리는 S. HEIDA 미셸, M. Geerdink, KM 드 겨울 드 그루, 그리고 G. Berkers (소아 호흡기학, 빌헬미나 어린이 병원, UMC 위트레흐트학과), 및 RHJ Houwen (소아 소화기, 빌헬미나의 부서에 감사드립니다 환자 접근과 CF 바이오 뱅크의 발전을 위해 조직 검사를 얻기를위한 어린이 병원, UMC 위트레흐트).
Materials
| Advanced Dulbecco’s Modified Eagles Medium with Nutrient Mixture F-12 Hams (Ad-DF) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #12634 | stored at 4 °C |
| GlutaMax | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #35050 | stored at 4 °C |
| Hepes | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | # 15630-056 | stored at 4 °C |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #15140-122 | stored at -20 °C |
| 96 well culture plate | Cellstar | #655180 | |
| 24 well culture plate | Cellstar | #662160 | |
| 6 well culture plate | Cellstar | #657160 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-) CaCl2 (-) MgCl2) (DPBS) | Life Technologies: Gibco | #14190-094 | stored at 4 °C |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM) 500ml | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #31966-021 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at 4 °C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Bovogen | #SFBS LOT#11113 | For Wnt-3A Conditioned Medium Production. Stored at -20 °C |
| L Wnt3A cell line | ATCC | #CRL-2647 | For Wnt-3A Conditioend Medium Production. |
| TOP/FOP plasmids | Millipore | #17-285 | For measuring Wnt activity |
| pTK-Renilla | Promega | #E2241 | For measuring Wnt activity |
| HEK-293 | ATCC | #CRL-1573 | For measuring Wnt activity |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | #E1910 | For measuring Wnt activity |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #R250-01 | For Wnt-3A Cell line selection |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific: Invitrogen | #17504-044 | stored at -20 °C |
| N-Acetylcysteine | Sigma Aldrich | #A9165-5G | stored at -20 °C |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | #N0636 | stored at -20 °C |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | PrepoTech | #AF-100-15 | stored at -20 °C |
| Gastrin | Sigma Aldrich | #G9145 | stored at -20 °C |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | Tocris | #2939 | stored at -20 °C |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | Selleckchem | #S1049 | stored at -20 °C |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma Aldrich | #S7067 | stored at -20 °C |
| Primocin | InvivoGen | #ant-pm-1 | stored at -20 °C |
| Human Noggin (hNoggin) | PrepoTech | #120-10C | stored at -20 °C |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | R&D Systems | #3500-RS/CF | stored at -20 °C |
| Vancomycin | Sigma Aldrich | #861987- 250mg | stored at -20 °C |
| Gentamycin | Life Technologies: Gibco | #15710-049 | stored at -20 °C |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | #431788 | Stored at 4 °C |
| Matrigel | Corning | #354230 | stored at -80 °C |
| TryplE Express | Life Technologies: Gibco | #12605-010 | for trypsinizing organoids for freezing |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies: Gibco | #12648010 | for freezing |
| Calcein | Life Technologies: Gibco | #C3100MP | stored at -20 °C |
| Forskolin | R&D Systems | #1099-50 mg | stored at -80 °C |
| Lumacaftor (VX-809) | Selleckchem | #s1565 | stored at -80 °C |
| Ivacaftor (VX-770) | Selleckchem | #s1144 | stored at -80 °C |
| Name of Reagents/Material | Solvent | Stock Concentration | Final Concentration |
| GlutaMax | 200 mM | 2m M | |
| Hepes | 1 M | 10 mM | |
| Penicillin/Streptomycin | 10K U/ml 10K µg/ml | 100 U/ml 100 µg/ml | |
| Zeocin | 100 mg/ml | 125 µg/ml | |
| B27 supplement | 100 x | 1 x | |
| N-Acetylcysteine | MiliQ H20 | 500 mM | |
| Nicotinamide | DPBS | 1 M | 10 mM |
| Human Epithelial Growth Factor (hEGF) | DPBS 0.1%BSA | 0.5 mg/ml | 50 ng/ml |
| Gastrin | DPBS | 100 µM | 10 nM |
| TGFb type I Receptor inhibitor (A83-01) | DMSO | 5 mM | 500 nM |
| Y-27632 dihydrochloride (RhoKi) | DMSO | 10 mM | 10 µM |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | DMSO | 30 mM | 10 µM |
| Primocin | 50 mg/ml | 100 µg/ml | |
| Human Noggin (hNoggin) | DPBS 0.1%BSA | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| Human R-spondin 3 (hRspo-3) | varies per lot | 300 ng/ml | |
| Vancomycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Gentamycin | 10 mg/ml | 50 µg/ml | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | MiliQ H20 | 0.5 M | 2 mM |
| Calcein | DMSO | 10 µg/ml | 3.3 ng/ml |
| Forskolin | DMSO | 10 mM | variable |
| Lumacaftor (VX-809) | DMSO | 20 mM | variable |
| Ivacaftor (VX-770) | DMSO | 20 mM | variable |
Riferimenti
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