Summary

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Published: January 24, 2017
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Summary

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

Abstract

외에도 ATP를 생성하는 자신의 중요한 역할에서, 미토콘드리아는 (칼슘) 단단히 세포 내 칼슘 농도를 조절하는 버퍼 지역 칼슘 역할을합니다. 이렇게하려면 미토콘드리아는 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (ΔΨ 분)에 걸쳐 전기 잠재력을 활용합니다. 미토콘드리아에 칼슘 이온의 유입은 산화 적 인산화 (OXPHOS) 착체를 통해 전자 전달을 증가 시트르산 사이클의 세 속도 제한게나 제를 자극한다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다.

우리는 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ의 m 여기하는 방법을 설명합니다. 세포를 permeabilizing, 미토콘드리아 칼슘에 의해 2+ 수형광 염료를 사용하여 테트라 메틸 ΔΨ m의 메틸 에스테르, 퍼클로레이트 (TMRM)의 측정을, 형광 칼슘 지표 FLUO-4 AM을 사용하여 측정 될 수있다. 이 시스템의 이점은 형광 염료 사이의 아주 작은 스펙트럼 오버랩 동시에 정확한 미토콘드리아의 Ca 2+ 및 측정 ΔΨ의 m을 수 있다는 것이다. 칼슘 분취의 순차 첨가를 사용하여 미토콘드리아 칼슘 흡수를 모니터 할 수 있으며, 칼슘 미토콘드리아 막 투과성 전이 및 ΔΨ의 손실을 유도하는 농도 결정 해요.

Introduction

미토콘드리아는 지역 칼슘 버퍼 1로 작용하여 세포 내 칼슘 농도를 조절하는데 중요한 역할을한다. 칼슘은 2 +, 칼슘 2 + uniporter 통해 미토콘드리아 내막 (ΔΨ 분) 2에서 존재하는 전기 화학적 구배에 의해 구동되는 과정을 미토콘드리아로 들어갑니다. 일단 미토콘드리아 매트릭스 내부, 칼슘은 구연산 사이클 (3)의 세 가지 속도 제한 탈수소 효소를 자극하여 산화 적 인산화를 활성화 할 수 있습니다. 이 자극은 양의 칼슘 이온이 미토콘드리아 매트릭스로 미토콘드리아 내막을 통과 일시적 소산 ΔΨ 분을 유지한다. 미토콘드리아 내의 칼슘 이온 농도가 매우 높아지면, 미토콘드리아 투과성 천이 ΔΨ의 m의 손실의 결과로, 초기화 될 수 있으며, cessatio산화 적 인산화 n 및 4 경로 신호 세포사의 유도.

미토콘드리아는 세포 칼슘의 공간 버퍼링에서 재생 중요한 역할은 미토콘드리아 칼슘의 정확한 모니터링이 중요합니다. 다양한 방법 로다 계 염료의 사용을 포함 미토콘드리아 칼슘을 모니터하기 위해 설립되었다. 그러한 염료, 루비로드-2, AM은 6 미토콘드리아 칼슘 레벨 5를 측정하는 미토콘드리아에 파티션에 매우 효과적이다. 몇몇 염료는 리포좀과 같은 다른 소기관에 축적 또는 세포 세포질에 남아 그러나, 치료가 사용되어야한다. 그럼에도 불구하고, 하류 분석 미토콘드리아 7 것과 이러한 신호들을 구별하기 위해 사용될 수있다.

미토콘드리아 칼슘을 모니터링하는 다른 기술은 형광 리포터 (8)를 구성 이용한다 </s >입니다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 이점은 특히, 예를 들어 인간 COX 소단위 VIII의 N- 말단 타겟팅 신호 내인성 N 말단 펩티드를 이용하여 미토콘드리아를 타겟팅 할 수 있다는 것이다. 이 시스템은 9 신호 미토콘드리아 칼슘 조사 매우 유용 입증되었다 미토콘드리아 타겟팅 쿼린 프로브를 생성하는데 사용되어왔다. 이러한 유 전적으로 인코딩 된 프로브의 주요 단점은 일시적인 발현에 의해 세포 내로 도입 될 필요가 (특정 세포 유형에 대해 가능하지 가변 결과를 얻을 수 있음) 또는 안정한 발현 시스템 (이는 시간이 소비된다) 만들어 있다는 것이다.

위에 설명 된 문제를 회피하기 위해, 우리는 동시에 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ m을 측정하는 새로운 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜은 투과성이 세포에 외인성 칼슘을 추가하는 전술 한 방법에 기초S = "외부 참조"> 10. 우리의 프로토콜은 다른 방법을 통해 세 가지 주요 이점이있다 : 첫째로, 우리는 FLUO-4, AM 및 TMRM는 미토콘드리아 칼슘과 ΔΨ 분, 매우 독특한 스펙트럼 특성을 갖는 두 개의 염료를 모니터링하는 데 사용할; 둘째, 세포는 FLUO-4 신호는 미토콘드리아 칼슘 감지하는 2 +와 칼슘이 다른 세포 소기관이나 세포의 세포질에 지역화되지 않도록 투과성이있다; 셋째, FLUO-4의 사용 2+ 미토콘드리아 칼슘 감지 유 전적으로 인코딩 된 프로브를 사용하는 경우 존재하는 세포 또는 형질 전환 문제를 부정 빠르고 간단한 세포 염색을 허용한다.

Protocol

세포의 1. 준비 10cm 세포 배양 접시에 세포 또는 75cm 성장 5 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S가 보충 배지 [10 ㎖ 둘 베코 변형 이글스 중간 (DMEM)에서 두 플라스크 ) 37 ° C / 5 % CO 2에서. 세포를 수확하려면 다음 5 ml의 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (1X PBS)로 세척, 흡인에 의해 용지를 제거합니다. 다음 (w / v)의 트립신 / 0.25 %를 1.5 ml의 0.2…

Representative Results

우리는 칼슘 (12)의 증가를 버퍼링 143B 세포 미토콘드리아의 능력에 MT-ND5 돌연변이의 영향을 조사하기 위해 프로토콜을 사용 하였다. 여기에 도시 된 예에서, 제어부 (143B) 세포 TMRM FLUO-4와 함께로드하고, 디기 토닌와 permeabilization 전에 AM. 촬상 5 분 후, 1 여덟 순차 추가 : CaCl2를 40 mM의 외인성 100 희석 최종 자유 칼슘 이온 농도로 만?…

Discussion

칼슘은 근육 수축, 신경 신호 전달 및 세포 증식 (13)를 포함한 많은 세포 공정에서 중요한 역할을한다. 세포의 칼슘 농도의 증가는 종종 직접 ATP 생성 3을 높이기 위해 미토콘드리아의 산화 적 인산화를 자극 할 수 칼슘, 에너지 수요와 연결되어 있습니다. 우리가 효과적으로 미토콘드리아 칼슘 축적을 모니터링하고,이 기능은 유전 적 요인 및 약리학 적 제제 모…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 금융 지원을 위해 박사 Kirstin Elgass 및 기술 지원 모나 마이크로 이미징 박사 사라 크리드, 그리고 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)과 의료 연구위원회 UK 감사합니다. MMcK는 호주 연구위원회 미래 원정대 제도 (FT120100459), 윌리엄 버클 랜드 재단, 호주 미토콘드리아 질환 재단 (AMDF), 의료 연구 및 모나 쉬 대학의 허드슨 연구소 지원됩니다. 이 작품은 빅토리아 정부 운영 인프라 지원 제도에 의해 지원되었다.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ThermoFisher 10566016
fetal bovine serum (FBS) ThermoFisher 16000044
1x phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher 10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s) ThermoFisher 15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA ThermoFisher 25200056
8-well chambered coverslip ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich 793566
KCl Sigma-Aldrich P9541 
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
KH2PO4 Sigma-Aldrich 795488
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 
CaCl2 Sigma-Aldrich 746495
HEPES Sigma-Aldrich H3375 
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670 
EGTA Sigma-Aldrich E4378 
HEDTA Sigma-Aldrich H8126 
malate Sigma-Aldrich M1000
glutamate Sigma-Aldrich G1626
ADP Sigma-Aldrich A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)  ThermoFisher 14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) ThermoFisher T668
Verapamil Sigma-Aldrich V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) ThermoFisher F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO) ThermoFisher D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
digitonin Sigma-Aldrich D141
thapsigargin Sigma-Aldrich T9033
Pluronic F-127  ThermoFisher P3000MP 
hemacytometer VWR 631-0925
10 cm cell culture dishes Corning COR430167
75 cm2 cell culture flasks Corning COR430641

Riferimenti

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check_url/it/55166?article_type=t

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Citazione di questo articolo
McKenzie, M., Lim, S. C., Duchen, M. R. Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55166, doi:10.3791/55166 (2017).

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