Mitochondrial कैल्शियम और mitochondrial झिल्ली के साथ माप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में संभावित
Summary
माइटोकॉन्ड्रिया (2 + सीए) कैल्शियम पृथक करने के लिए उनके भीतर की झिल्ली (Δ Ψm) भर में विद्युत क्षमता का उपयोग कर सकते हैं, उन्हें 2 + साइटोसोलिक सीए आकार देने के लिए कोशिका के भीतर संकेत की इजाजत दी। हम एक साथ मापने माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 तेज और ΔΨ मीटर जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट रंगों और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Abstract
इसके अलावा एटीपी पैदा करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका से, माइटोकॉन्ड्रिया भी (सीए 2) कसकर intracellular सीए 2 + एकाग्रता को विनियमित करने के लिए बफ़र्स स्थानीय कैल्शियम के रूप में काम करते हैं। ऐसा करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 पृथक करने के लिए उनके भीतर की झिल्ली (ΔΨ मीटर) के पार विद्युत क्षमता का उपयोग। सीए 2 की आमद माइटोकॉन्ड्रिया में साइट्रिक एसिड चक्र के तीन दर सीमित डीहाइड्रोजनेज उत्तेजित करता है, आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) परिसरों के माध्यम से इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण बढ़ रही है। इस उत्तेजना ΔΨ मीटर है, जो अस्थायी रूप से व्यस्त है के रूप में सकारात्मक कैल्शियम आयनों mitochondrial मैट्रिक्स में mitochondrial भीतरी झिल्ली को पार बनाए रखता है।
हम यहाँ एक साथ मापने माइटोकॉन्ड्रिया सीए 2 तेज और ΔΨ मीटर जीवित कोशिकाओं में confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक विधि का वर्णन। कोशिकाओं permeabilizing, mitochondrial सीए द्वारा 2 + कर सकते हैं, फ्लोरोसेंट सीए 2 + सूचक Fluo 4, AM उपयोग करके मापा जा ΔΨ मीटर फ्लोरोसेंट रंजक tetramethylrhodamine का उपयोग कर, मिथाइल एस्टर, perchlorate (TMRM) की माप के साथ। इस प्रणाली का लाभ फ्लोरोसेंट रंगों के बीच बहुत कम वर्णक्रमीय ओवरलैप है कि वहाँ, mitochondrial सीए का सही माप 2 + और ΔΨ मीटर एक साथ की अनुमति है। सीए 2 aliquots के अनुक्रमिक इसके प्रयोग, mitochondrial सीए 2 तेज नजर रखी जा सकती है, और एकाग्रता, जिस पर सीए 2 लाती mitochondrial झिल्ली पारगम्यता संक्रमण और ΔΨ के नुकसान चुना गया हूँ।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया स्थानीय सीए 2 बफ़र्स 1 के रूप में अभिनय द्वारा intracellular सीए 2 + एकाग्रता को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सीए 2, विद्युत ढाल कि mitochondrial भीतरी झिल्ली (ΔΨ मीटर) 2 भर में मौजूद है के द्वारा संचालित एक प्रक्रिया के माध्यम से सीए 2 uniporter माइटोकॉन्ड्रिया में प्रवेश करती है। एक बार जब mitochondrial मैट्रिक्स के अंदर, सीए 2 साइट्रिक एसिड चक्र 3 के तीन दर सीमित डीहाइड्रोजनेज प्रेरक द्वारा आक्सीकारक फास्फारिलीकरण सक्रिय कर सकते हैं। इस उत्तेजना ΔΨ मीटर है, जो अस्थायी रूप से व्यस्त है के रूप में सकारात्मक कैल्शियम आयनों mitochondrial मैट्रिक्स में mitochondrial भीतरी झिल्ली को पार बनाए रखता है। माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सीए 2 एकाग्रता बहुत अधिक हो जाता है, mitochondrial पारगम्यता संक्रमण, शुरू किया जा सकता ΔΨ मीटर के अपव्यय में जिसके परिणामस्वरूप, cessatioआक्सीकारक फास्फारिलीकरण के एन और रास्ते 4 संकेत कोशिका मृत्यु का प्रेरण।
महत्वपूर्ण भूमिका है कि माइटोकॉन्ड्रिया सेलुलर कैल्शियम के स्थानिक बफरिंग में खेलने mitochondrial कैल्शियम की सही निगरानी के लिए महत्वपूर्ण बना देता है। विभिन्न तरीकों rhodamine आधारित रंगों के उपयोग सहित mitochondrial कैल्शियम, निगरानी के लिए स्थापित किया गया है। ऐसा ही एक डाई, Rhod-2, AM, माइटोकॉन्ड्रिया को विभाजन पर काफी प्रभावी, 6 mitochondrial सीए 2 का स्तर 5 उपाय है। हालाँकि, ध्यान के रूप में कुछ ऐसे डाई liposomes के रूप में अन्य अंगों में जमा करेंगे, या सेल cytosol में रहने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। फिर भी, नीचे की ओर विश्लेषण माइटोकॉन्ड्रिया 7 से उन लोगों से इन संकेतों को अलग करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
एक और तकनीक mitochondrial कैल्शियम की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर constructs 8 का इस्तेमाल </s > अप। इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच के लाभ यह है कि वे विशेष रूप से अंतर्जात एन टर्मिनल पेप्टाइड्स मानव कॉक्स सबयूनिट आठवीं के एन टर्मिनल लक्ष्यीकरण संकेत का उपयोग, उदाहरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना बनाया जा सकता है। इस प्रणाली के एक mitochondrial-लक्षित aequorin जांच जो mitochondrial कैल्शियम 9 संकेत जांच के लिए अत्यंत उपयोगी साबित हुई है उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। इन आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच का मुख्य दोष यह है कि वे क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा कोशिकाओं में पेश किए जाने की जरूरत है (जो कुछ प्रकार की कोशिकाओं के लिए संभव नहीं है और चर परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं) या स्थिर अभिव्यक्ति सिस्टम (जो समय लगता है) बनाने से है।
समस्याओं के ऊपर उल्लिखित नाकाम करने के लिए, हम एक साथ mitochondrial सीए 2 और ΔΨ मीटर को मापने के लिए एक नए प्रोटोकॉल विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित विधि कि permeabilized कोशिकाओं को बहिर्जात कैल्शियम कहते हैं पर आधारित हैएस = "xref"> 10। हमारी प्रोटोकॉल अन्य तरीकों पर तीन मुख्य फायदे हैं: सबसे पहले, हम Fluo 4, AM और TMRM mitochondrial सीए 2 और ΔΨ मीटर, दो रंगों बहुत ही अलग वर्णक्रम गुण है कि निगरानी के लिए उपयोग करें; दूसरी बात, कोशिकाओं permeabilized कर रहे हैं ताकि Fluo 4 संकेत ही mitochondrial सीए का पता लगाने है 2 + 2 + और सीए अन्य अंगों या सेल cytosol के लिए नहीं स्थानीय; और तीसरे, Fluo 4 के उपयोग mitochondrial सीए पता लगाने के लिए 2 +, किसी भी सेल अभिकर्मक या परिवर्तन के मुद्दों है कि यदि आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच का उपयोग मौजूद नकार तेज और सरल सेल धुंधला के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैल्शियम मांसपेशियों के संकुचन, न्यूरोनल संकेतन और सेल प्रसार 13 सहित कई सेल प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेल कैल्शियम की सांद्रता में वृद्धि अक्सर ऊर्जा की मांग के साथ जु?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वित्तीय सहायता के लिए डॉ Kirstin Elgass और तकनीकी सहायता के लिए मोनाश माइक्रो इमेजिंग से डॉ सारा पंथ, और वेलकम ट्रस्ट और चिकित्सा अनुसंधान परिषद ब्रिटेन धन्यवाद। MMcK ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप योजना (FT120100459), विलियम बकलैंड फाउंडेशन, ऑस्ट्रेलियाई Mitochondrial रोग फाउंडेशन (AMDF), चिकित्सा अनुसंधान और मोनाश विश्वविद्यालय के हडसन इंस्टीट्यूट का समर्थन किया है। इस काम विक्टोरियन सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं का समर्थन योजना के द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
Riferimenti
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