Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Summary

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ _Ψm) di sequestrare il calcio (Ca ^2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico ^{2 +} Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Abstract

Oltre al loro ruolo fondamentale nel generare ATP, i mitocondri fungono anche da calcio locale (Ca ²⁺⁾ buffer per regolare strettamente concentrazione intracellulare di Ca ^2+. Per fare questo, mitocondri utilizzano il potenziale elettrochimico attraverso la membrana interna (ΔΨ _m) di sequestrare Ca ^2+. L'afflusso di Ca ²⁺ nei mitocondri stimola tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico, aumentare il trasferimento di elettroni attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS) complessi. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale.

Descriviamo qui un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca ²⁺ di assorbimento e ΔΨ _m in cellule vive usando la microscopia confocale. Con permeabilizzante le cellule, Ca ²⁺ mitocondriale puòessere misurata utilizzando la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Fluo-4, AM, con la misura di _m ΔΨ utilizzando il tetramethylrhodamine colorante fluorescente, estere metilico, perclorato (TMRM). Il vantaggio di questo sistema è che c'è poca sovrapposizione spettrale tra i coloranti fluorescenti, consentendo una misurazione precisa della mitocondriale Ca ²⁺ e ΔΨ _m simultaneamente. Utilizzando l'aggiunta sequenziale di Ca ²⁺ aliquote, Ca ²⁺ mitocondriale assorbimento possono essere monitorati, e la concentrazione alla quale Ca ²⁺ induce mitocondriale transizione di permeabilità della membrana e la perdita di ΔΨ _M determinato.

Introduction

I mitocondri svolgono un ruolo importante nella regolazione intracellulare concentrazione di Ca ^2+, agendo come locali Ca ²⁺ buffer ^1. Ca ²⁺ entra nei mitocondri attraverso il Ca ²⁺ uniporter, un processo guidato dal gradiente elettrochimico che esiste attraverso la membrana mitocondriale interna (ΔΨ _m) ^2. Una volta all'interno della matrice mitocondriale, Ca ²⁺ può attivare fosforilazione ossidativa stimolando tre deidrogenasi rate-limiting del ciclo dell'acido citrico ^3. Questa stimolazione mantiene ΔΨ _m, che viene temporaneamente dissipata come gli ioni di calcio positivi attraversare la membrana mitocondriale interna nella matrice mitocondriale. Se il Ca ²⁺ concentrazione ai mitocondri diventa molto alta, transizione di permeabilità mitocondriale può essere avviata, con conseguente dissipazione di ΔΨ _m, la cessation di fosforilazione ossidativa e l'induzione della morte cellulare vie di segnalazione ^4.

Il ruolo importante che i mitocondri giocano nel buffer spaziale del cellulare di calcio rende il monitoraggio accurato del calcio mitocondriale critica. Vari metodi sono stati stabiliti per monitorare calcio mitocondriale, compreso l'uso di coloranti a base di rodamina. Uno di questi dye, Rhod-2, AM, è molto efficace nel partizionamento ai mitocondri per misurare mitocondriali di Ca ²⁺ livelli ^{5, 6.} Tuttavia, la cura deve essere utilizzato come una tintura si accumulerà in altri organelli, come liposomi, o rimanere nel citosol delle cellule. Tuttavia, analisi a valle possono essere impiegati per distinguere questi segnali da quelli dai mitocondri ^7.

Un'altra tecnica per monitorare il calcio mitocondriale utilizza reporter fluorescente costrutti ⁸ </s up>. Il vantaggio di queste sonde geneticamente codificati è che possono essere specificamente mirata ai mitocondri utilizzando endogeni peptidi N-terminali, ad esempio il segnale di targeting N-terminale della subunità COX umana VIII. Questo sistema è stato impiegato per generare una sonda equorina mitocondriale targeting che si è dimostrata estremamente utile per studiare calcio mitocondriale segnalazione ^9. L'inconveniente principale di queste sonde geneticamente codificate è che hanno bisogno di essere introdotti nelle cellule di espressione transitoria (che non è fattibile per alcuni tipi di cellule e possono produrre risultati variabili) o attraverso la creazione di sistemi di espressione stabili (che richiede molto tempo).

Per aggirare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per misurare mitocondriale Ca ²⁺ e ΔΨ _m contemporaneamente. Questo protocollo si basa su un metodo precedentemente descritto che aggiunge calcio esogeno per cellule permeabilizzates = "xref"> 10. Il nostro protocollo ha tre vantaggi principali rispetto ad altri metodi: in primo luogo, usiamo Fluo-4, AM e TMRM per monitorare Ca ²⁺ mitocondriale e ΔΨ _m, due coloranti che hanno ben distinte proprietà spettrali; in secondo luogo, le cellule vengono permeabilizzate modo che il segnale Fluo-4 è solo rilevando mitocondriale Ca ²⁺ e non Ca ²⁺ localizzato ad altri organelli o citosol delle cellule; e in terzo luogo, l'uso di Fluo-4 per rilevare Ca ²⁺ mitocondriale consente per la colorazione delle cellule veloce e semplice, negando eventuali problemi di trasfezione cellulare o trasformazione esistenti se si usano sonde geneticamente codificati.

Protocol

1. Preparazione di cellule Crescere le cellule in 10 cm piatti di coltura cellulare o 75 cm 2 palloni in terreni di coltura [10 ml di Dulbecco Eagles Modificati (DMEM) integrato con il 5% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1x penicillina / streptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% CO 2. Per raccogliere le cellule, rimuovere il supporto per aspirazione, quindi lavare con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS 1x). Rimuovere 1x PBS mediante aspirazione, quindi aggiungere 1,5 ml di 0,25…

Representative Results

Abbiamo usato questo protocollo per esaminare gli effetti di una mutazione MT-ND5 sulla capacità dei mitocondri delle cellule 143B per tamponare gli aumenti di calcio 12. Nell'esempio mostrato qui, le cellule 143B di controllo sono stati caricati con TMRM e Fluo-4, sono davanti a permeabilizzazione con digitonina. Dopo 5 minuti di immagini, otto aggiunte sequenziali di un diluizione 1: 100 di 40 mm esogeni CaCl 2 sono stati fatti, con la c…

Discussion

Il calcio gioca un ruolo fondamentale in molti processi cellulari, tra cui la contrazione muscolare, la segnalazione neuronale e proliferazione cellulare ^13. Aumento delle concentrazioni di calcio delle cellule sono spesso associati con la domanda di energia, con il calcio in grado di stimolare direttamente fosforilazione ossidativa mitocondriale per aumentare la produzione di ATP ^3. E 'quindi essenziale che abbiamo la capacità di controllare efficacemente l'accum…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641