Exame de fenótipos de acolhimento em<em> Gambusia affinis</em> Após o tratamento antibiótico

Summary

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

Foi estabelecido que os antibióticos podem perturbar o microbioma humano levando a dysbiosis, o que significa um desequilíbrio comunidade microbiana. Alteração da composição da microbiota após tratamentos com antibióticos foi demonstrado para diminuir a diversidade da comunidade, reduzir os membros-chave, e alterar o metabolismo da comunidade, especialmente no intestino ^{1, 2.} Perturbação antibiótico do microbioma intestinal pode reduzir a resistência à colonização a Clostridium difficile ^{3, 4} e ⁵ Salmonella.

Além disso, a interrupção da microbiota tem sido associada com o desenvolvimento de muitas doenças e síndromes em seres humanos (por exemplo, associada a antibióticos enterocolite, doença inflamatória do intestino, desordens metabólicas, etc.). Os antibióticos também são amplamente implementadas na agricultura como promotores de crescimento nagado e aves de produção ^6. O uso dessas ferramentas poderosas não é sem efeitos colaterais, o que é evidente no rápido aumento da resistência aos antibióticos, bem como os efeitos de um microbioma interrompido tem com seu hospedeiro habitado. Muitos estudos têm mostrado que o amplo espectro da utilização de antibióticos tem longos consequências duradouras para a estrutura e função da microbiota, mas os efeitos colaterais de um microbioma impactando fisiologia acolhimento interrompido aos antibióticos são apenas especulações que ainda têm de ser suportados.

A interação entre hospedeiros, microbiota e antibióticos está longe de ser entendida de uma forma concisa. Portanto, um modelo simples e mais tratável é vantajoso para lançar luz sobre o sistema de mamíferos altamente complexa. superfícies mucosas em seres humanos, incluindo o intestino, abrigam a maior densidade e diversidade de micróbios, e também as interações entre microorganismos e acolhimento mais íntimos. O microbioma da pele da mucosa oferece peixes svantagens everal como um sistema modelo. O Teleostei (peixes ósseos) é uma das primeiras linhagens a divergir na acepção Vertebrados que teleósteos ter tanto inata e adquirida sistemas imunitários que co-evoluíram um relacionamento com comunidades bacterianas comensais ^7. Partes de pele de peixe muitas características com as superfícies das mucosas um tipo de mamíferos, tais como as funções fisiológicas, componentes de imunidade, e arranjo de células produtoras de muco ^8. A localização externa da superfície do peixe pele mucosa oferece um microbioma fácil de manipular experimentalmente e amostra.

O mosquitofish Ocidental, Gambusia affinis (G. affinis), é um modelo de peixe que tem sido utilizado no passado para o estudo de toxicologia de acoplamento e ^{9, 10, 11.} Dado o pequeno tamanho, abundância população em estado selvagem como uma espécie invasora, m o custo de cuidados inimal e natureza resistente, temos desenvolvido G. affinis como um modelo microbioma mucosa. Além disso, Gambusia compartilhar a fisiologia de dar à luz filhotes vivos com mamíferos vivíparos, o que é raro em espécies de peixes. Nós completaram o estudo mais extenso no momento da pele de peixe microbiota normal usando 16S perfilar com Gambusia ^12. Além disso trabalho demonstrou três efeitos negativos sobre o hospedeiro seguintes perturbações da pele e da flora intestinal através de um antibiótico de largo espectro ^13.

Cinco efeitos diferentes foram examinados nos peixes após a exposição aos antibióticos. O benefício de acolhimento mais bem estabelecida do microbioma é a exclusão competitiva de patógenos. O patógeno peixes Edwardsiella ictaluri é conhecido por causar surtos de septicemia entérica em fazendas catfish comerciais ^14. E. ictaluri também foi mostrado para infectar letalmente peixe-zebraclass = "xref"> ^{15, 16} e ¹⁷ Gambusia. Um desafio com este agente patogénico a partir da coluna de água pode servir como uma medida de exclusão. Como uma comparação para susceptibilidade a um patógeno indivíduo, sobrevivência durante a exposição a uma alta densidade de organismos mistos também foi efectuada. Fezes e solo orgânico-ricos foram usados ​​como fontes comumente encontradas de comunidades microbianas.

Outro papel estabelecido a comunidade intestino bacteriana executa é o processamento de nutrientes e energia colheita, afetando a absorção nutricional global para o anfitrião. Como uma medição bruta de alimentação, o peso do corpo dos peixes foi comparado antes e depois de um mês de ser alimentados com uma dieta padrão. Tratados com antibióticos de peixe como uma média perderam peso, enquanto peixes de controle, em média, ganho de peso ao longo do mês. O mecanismo para esta falta de ganho de peso não é clara. Um factor que contribui possível é o tempo de trânsito dos alimentos no intestino. A moti GIlidade método foi adaptado do peixe-zebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicação pessoal) para determinar o tempo de trânsito. Ainda não foi determinado se os peixes tratados com antibiótico tem um tempo de trânsito alterada.

Um desafio comum vivida no ambiente natural por todos os organismos, especialmente peixes, é o estresse osmótico. Gambusia foram mostrados para adaptar-se rapidamente quando agudamente sublinhado em altas concentrações de salinidade ^18. Surpreendentemente, os peixes com um microbioma alterou a antibióticos exibiu reduzido sobrevivência a uma tensão elevada de sal. O mecanismo para este romance fenótipo está sob investigação. Outro esforço comum em animais aquáticos, especialmente em aquários, é formas tóxicas de azoto (amoníaco, nitrato e nitrito). Sobrevivência contra o nitrato não foi significativamente diferente entre os tratados com antibiótico e controle de peixe. Os métodos apresentados neste manuscrito pode ser usado com ou Gambusia modelo peixe semelhante organismos, tais como zebrapeixes e medaka, para medir fenótipos nos peixes após a manipulação experimental.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação de protocolos IACUC, numeradas 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manuseio e cuidados éticos Recolha Gambusia affinis do local de campo (guia de identificação no http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) usando uma pequena rede de mergulho e coloque em 19 baldes L. Use inspeção visual para identificar as espécies. peixes descanso para 1-2 d em um balde…

Representative Results

Um diagrama esquemático geral do sistema experimental utilizado para estudar os efeitos da exposição do hospedeiro peixe antibiótico 13 está representada na Figura 1A e inclui a técnica para a extracção da pele (Figura 1B) e intestino (Figura 1C) microbiomas do peixe. Três dias foi seleccionado como o período de exposição aos antibióticos porque dados anteriores revela que, enquanto o número total de…

Discussion

Alguns desafios requerem um período de descanso na APW limpo após o tratamento antibiótico para a droga para ser empobrecido em tecidos de peixes. Se o período de descanso é ignorado, então a presença de antibióticos podem confundir os resultados, especialmente quando o ensaio envolve a exposição a bactérias. A fim de examinar os efeitos de uma composição microbioma alterada sem grandes alterações no número total de micróbios no host, experimentos preliminares monitorização da composição da microbio…

Materials

Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
PBS tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline