Undersökning av värd Fenotyper i<em> Gambusia affinis</em> Efter antibiotikabehandling

Summary

Denna studie involverar metoder för att avslöja effekterna på en modell fisk värd följande förändring av huden och tarmen microbiome samhällen komposition genom ett antibiotikum.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

Det har fastställts att antibiotika kan störa den mänskliga microbiome leder till dysbios, vilket betyder ett mikrobiella obalans. Mikrobiota s sammansättning förändring efter antibiotikabehandlingar har visat sig sänka samhällets mångfald, minska nyckelpersoner, och ändra gemenskap metabolism, särskilt i tarmen ^{1, 2.} Antibiotikum störning av tarmen microbiome kan minska kolonisering resistens mot Clostridium difficile ^{3, 4} och Salmonella ^5.

Dessutom har störningar i mikrobiota kopplats till utvecklingen av många syndrom och sjukdomar hos människor (t.ex. antibiotikaassocierad enterokolit, inflammatorisk tarmsjukdom, metabola sjukdomar, osv.). Antibiotika är också allmänt tillämpas inom jordbruket som tillväxtbefrämjande medel iboskap och fjäderfäproduktion ^6. Användningen av dessa kraftfulla verktyg är inte utan bieffekter, vilket är tydligt i den snabba ökningen av antibiotikaresistens, samt effekterna av en störd microbiome har med sin bebodda värd. Många studier har visat att bredspektrumantibiotikaanvändning har långvariga konsekvenser för struktur och funktion hos mikrobiota, ännu biverkningar från en antibiotika störs microbiome påverkar värd fysiologi är bara spekulationer som ännu inte stöds.

Samspelet mellan värd, mikrobiota, och antibiotika är långt ifrån förstås på ett kortfattat sätt. Därför är en enkel och mer lätthanterlig modell fördelaktigt att belysa den mycket komplexa däggdjurssystem. Slemhinneytor hos människor, inklusive tarmen, hamnen den högsta tätheten och mångfalden av mikrober, och även de mest intima mikrob-värd interaktioner. Mucosal hud microbiome fisk erbjuder several fördelar som ett modellsystem. Den Teleostei (benfiskar) är en av de tidigaste linjerna divergerar i Vertebrata mening att teleosts har både medfödda och förvärvade immunsystem som har samar utvecklat en relation med kommenbakteriesamhällen ^7. Fisk hud delar många egenskaper med typ 1 slemhinneytor hos däggdjur, såsom fysiologiska funktioner, immunitets komponenter och arrangemang av slemproducerande celler ^8. Den externa placeringen av fiskskinn slemhinneyta erbjuder en microbiome lätt att experimentellt manipulera och prov.

Den västra moskitfisk, Gambusia affinis (G. affinis), är en modell fisk som har använts i det förflutna för att studera parning och toxikologi ^{9, 10, 11.} Med tanke på den lilla storleken, befolknings överflöd i naturen som en invasiv art, m inimal vård kostnad och härdiga natur, har vi utvecklat G. affinis som en slemhinna microbiome modell. Vidare, Gambusia delar fysiologi föder levande ungar med viviparous däggdjur, vilket är ovanligt i fiskarter. Vi avslutade den mest omfattande studien vid tidpunkten för fiskskinn normal mikrobiota använder 16S profilering med Gambusia ^12. Ytterligare arbete visade tre negativa effekter på värd efter avbrott i huden och tarmfloran med hjälp av ett brett spektrum antibiotikum ^13.

Fem olika effekter undersöktes i fisken efter antibiotika exponering. Den mest väletablerade värd förmån för microbiome är konkurrenskraftig uteslutning av patogener. Fisken patogen Edwardsiella ictaluri är känd för att orsaka utbrott av enter septikemi i kommersiella havskatt gårdarna ^14. E. Siella ictaluri har också visat sig dödligt infektera zebrafiskclass = "xref"> ^{15, 16} och Gambusia ^17. En utmaning med denna patogen från vattnet kan fungera som ett mått på utslagning. Som en jämförelse med mottaglighet för en enskild patogen, var överlevnad under exponering för en hög täthet av blandade organismer också utföras. Avföring och organiskt-rik jord användes som gemensamt stött källor mikrobiella samhällen.

En annan etablerad roll bakterietarm samhället utför är närings bearbetning och energi skörd, vilket påverkar den totala näringsupptaget för värden. Som en grov mätning av näring, var fisk kroppsvikt jämfört före och efter en månad av matas en standarddiet. Antibiotikabehandlade fisk som ett genomsnitt gått ner i vikt medan kontrollfisk i genomsnitt gått upp i vikt under månaden. Mekanismen för denna brist på viktökning är oklar. En möjlig bidragande orsak är transittiden av mat i tarmen. En GI motitets metod anpassades från zebrafisk (Adam Rich, SUNY Brockport, personlig kommunikation) för att bestämma överföringstiden. Det har ännu inte fastställts om antibiotikabehandlade fisk har en förändrad transittiden.

En gemensam utmaning med erfarenhet i den naturliga miljön av alla organismer, särskilt fisk, är osmotisk stress. Gambusia har visat att snabbt anpassa sig när akut betonade i höga koncentrationer av salthalt ^18. Överraskande, fisk med en antibiotika förändrad microbiome uppvisade sänkt överlevnad till en hög saltstress. Mekanismen för denna nya fenotyp är under utredning. En annan vanlig stress på vattenlevande djur, särskilt i akvarier, är giftiga former av kväve (ammoniak, nitrat och nitrit). Överlevnad mot nitrat var inte signifikant olika mellan antibiotika-behandlade och kontrollfisk. De metoder som presenteras i detta manuskript kan användas med Gambusia eller liknande fisk modellorganismer, såsom zebrafisk och medaka, att mäta fenotyper i fisken efter experimentell manipulation.

Protocol

Alla djurförsök utfördes under godkännande av IACUC protokoll, numrerade 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 och 14-04-17-1018-3-01. 1. Animaliska insamling, hantering och etisk Care Samla Gambusia affinis från fält webbplats (identifiering guide på http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) med en liten dip net och plats i 19 L hinkar. Använd visuell inspektion för att identifiera arter. Resten fisk för 1-2 d i en hink med damm vatten. Efteråt överföra fisk…

Representative Results

En övergripande schematiskt diagram över den experimentella system som används för att studera fisk värdeffekter från antibiotikum exponering 13 representeras i figur 1A och innefattar den teknik för att extrahera huden (Figur 1B) och tarm (Figur 1C) microbiomes från fisken. Tre dagar valdes som antibiotika exponeringstiden, eftersom tidigare data visar att medan den totala huden odlingsbara antal droppar …

Discussion

Vissa utmaningar kräver en viloperiod i ren APW efter antibiotikabehandling för det läkemedel som skall utarmas på fiskvävnad. Om viloperiod hoppas då antibiotika närvaro kan förbrylla resultaten, särskilt när analysen innebär exponering för bakterier. För att undersöka effekterna av en förändrad microbiome komposition utan stora förändringar i det totala antalet mikrober på värden, preliminära experiment övervakning microbiome sammansättning (16S profilering eller hela genomet sekvensering) och b…

Materials

Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
PBS tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline