Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Summary

Il modello orecchio del mouse SKH1-Hr ^hr hairless consente intravitale microscopia a fluorescenza del microcircolo e fototossico induzione trombo senza previa preparazione chirurgica nel letto microvascolare esaminato. Pertanto, l'orecchio del topo glabro è un eccellente modello in vivo per studiare le complesse interazioni durante la formazione di trombi microvascolare, l'evoluzione del trombo, e trombolisi.

Abstract

complicanze trombotiche di malattie vascolari sono una delle principali cause di morbilità e mortalità nei paesi industrializzati. A causa delle complesse interazioni tra cellule ematiche e non cellulari durante la formazione di trombi, studi affidabili della fisiologia e fisiopatologia della trombosi possono essere eseguite solo in vivo. Pertanto, questo articolo presenta un modello orecchio nei topi senza peli e si concentra sull'analisi in vivo del microcircolo, formazione di trombi, e l'evoluzione del trombo. Utilizzando intravitale microscopia a fluorescenza e la via endovenosa (iv) l'applicazione dei rispettivi coloranti fluorescenti, un'analisi ripetitiva di microcircolazione del padiglione auricolare può facilmente realizzabile, senza la necessità di preparazione chirurgica. Inoltre, questo modello può essere adattato per studi in vivo su temi diversi, tra cui la guarigione delle ferite, danno da riperfusione, o di angiogenesi. In sintesi, l'orecchio di topi glabri è un modello ideale per la a vivo studio della microcircolazione cutanea in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche e per la valutazione della sua reazione a differenti trattamenti sistemici o topici.

Introduction

Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale applicata al padiglione auricolare del mouse senza peli per l'osservazione diretta e l'analisi del microcircolo, formazione di trombi, ed evoluzione trombo. Con un'incidenza di 1 a 1.000, trombosi venosa è ancora una causa comune di morbidità. Anche se la diagnostica, le strategie di prevenzione e le terapie sono stati sviluppati negli ultimi anni, un terzo di trombosi venosa si manifesta come un'embolia polmonare ^1. trombosi arteriosa gioca un ruolo fondamentale nelle malattie cardiovascolari, che sono la causa più comune di morte nei paesi industrializzati. trombosi arteriosa in base alla rottura di placche aterosclerotiche è coinvolto in attacchi cardiaci, infarti mesenterici, e un colpo apoplettico. Ogni intervento chirurgico espone strutture subendoteliali ai componenti del sangue, cambia la dinamica del flusso di sangue, e immobilizza il paziente. Nella chirurgia endoprotesico del arto inferiore, t organoransplantation e trombosi chirurgia lembo sono spesso causa di complicazioni. Microvascolare trombosi in particolare provoca spesso danni irreversibili, a causa della mancanza di sintomi clinici. Analogamente, trombosi microvascolare gioca un ruolo cruciale in diverse patologie, incluse porpora trombotica trombocitopenica, sepsi, coagulazione intravascolare disseminata, sindrome antifosfolipidi, e insufficienza venosa cronica, tra gli altri.

Diversi nuovi farmaci per la terapia e la prevenzione della trombosi sono stati sviluppati negli ultimi anni, ma i farmaci antiaggreganti e anticoagulanti hanno ancora effetti collaterali, antagonisti mancanza, e presentano gli effetti di lunga durata. Queste carenze portano a problemi di assistenza medica di emergenza. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per scoprire i complessi processi che si verificano durante la trombosi, che difficilmente può essere simulato in vitro.

Il topo glabro ^hr SKH1-Hr è stato scoperto 1926 in uno zoo di Londra.A causa di un difetto genetico sul cromosoma 14, l'animale perde il pelo dopo postnatale giorno 10. Questo rende il padiglione auricolare ben vascolarizzato accessibile a microscopia intravitale dei vasi. Lo spessore medio dell'orecchio è di 300 micron. È costituita da due strati di derma, che sono separati da cartilagine. Sul lato dorsale convessa della cartilagine, 3 fasci vascolari entrano lobo. archi vascolari apicali e basali shunt collegano i tre fasci. Venule hanno diametri tra 200 um (basale) e 10 um (apicale). Capillari a maglie strette circondano i capelli vuoto follicoli ^2. L'anatomia del mouse ^hr SKH1-Hr glabro rende il padiglione auricolare un modello potente e conveniente per la ricerca trombosi.

Protocol

Tutti gli esperimenti in vivo (7221.3-1-006 / 15) sono state condotte in conformità con la legislazione tedesca in materia di protezione degli animali e la Guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio (Istituto di laboratorio risorse animali, Consiglio Nazionale delle Ricerche). 1. Mantenere generale degli animali Eseguire gli esperimenti con i topi hr SKH1-Hr maschi di età compresa tra 4 a 6 settimane. Utilizzare gli animali con un peso compre…

Representative Results

Effetti del trattamento cannabinoidi su trombogenesi Sull'iniezione di 0,05 mL di FITC-destrano, fototossica induzione trombo porta ad una lesione endoteliale e la formazione di un tappo di piastrine parietale (figure 2 e 3). Nel presente studio, induzione trombo dopo l'iniezione ip di cannabinoidi (5 mg / kg di peso corporeo) o un veicolo determinato un'occlusione trombotica recipien…

Discussion

Ci sono diversi passaggi critici per l'induzione trombo successo nel lobo di topi ^hr SKH1-HR. Per problemi, le rispettive fasi del protocollo sono indicati tra parentesi.

condizioni di esame sono ideali in animali giovani all'età di 4 – 6 settimane ed a basso cheratinizzazione dell'epidermide. Negli animali più vecchi, la qualità di visualizzazione dei vasi è peggiore e meno paragonabili a causa della distanza maggiore tra la superficie della pelle e dei vasi bersa…

Materials

SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20x/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63x/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
plasters	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14,5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
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