Intravital mikroskopi och trombos induktion i örsnibben av en hårlös mus

Summary

Örat modell av den hårlösa SKH1-Hr ^hr mus möjliggör intravital fluorescensmikroskopi av mikrocirkulationen och fototoxisk tromb induktion utan föregående kirurgisk beredning i den undersökta mikrovaskulära bädden. Därför är örat av den hårlösa musen ett utmärkt in vivo-modell för att studera de komplexa interaktioner under mikrovaskulär trombbildning, tromb evolution och trombolys.

Abstract

Trombotiska komplikationer av kärlsjukdomar är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i industriländerna. På grund av att de komplexa interaktionerna mellan cellulära och icke-cellulära blodkomponenter under trombbildning, kan tillförlitliga studier av fysiologi och patofysiologi av trombos endast utföras in vivo. Därför denna artikel presenteras en öronmodell hårlösa möss och fokuserar på analys av mikrocirkulationen, blodproppsbildning och tromb evolution in vivo. Genom användning av intravital fluorescensmikroskopi och intravenös (iv) applicering av respektive fluorescerande färgämnen, kan lätt utföras en repetitiv analys av mikrocirkulationen i hjärtörat, utan behov av kirurgisk beredning. Dessutom kan denna modell anpassas för in vivo-studier av olika frågor, inklusive sårläkning, reperfusionsskada, eller angiogenes. Sammanfattningsvis är örat av hårlösa möss en idealmodell för in vivo studie av hud mikrocirkulation i fysiologiska eller patofysiologiska tillstånd och för utvärdering av dess reaktion på olika systemiska eller utvärtes behandlingar.

Introduction

Syftet med denna artikel är att beskriva den teknik för intravital mikroskopi appliceras på hjärtörat av den hårlösa musen för direkt observation och analys av mikrocirkulationen, trombbildning, och tromb evolution. Med en incidensen av en i 1000, är ​​venös trombos fortfarande en vanlig orsak till sjuklighet. Även diagnostik, förebyggande strategier och behandlingar har utvecklats under de senaste åren, en tredjedel av ventrombos manifesterar som en lungemboli ^1. Arteriell trombos spelar en avgörande roll i hjärt- och kärlsjukdomar, som är den vanligaste dödsorsaken i industriländerna. Arteriell trombos baseras på bristning av aterosklerotiska plack är involverad i hjärtinfarkt, mesenteriska infarkter och slaganfall. Varje operation exponerar subendoteliala strukturer till blodkomponenter, ändrar dynamiken i blodflödet, och immobiliserar patienten. I endoprotesanordning kirurgi av den nedre extremiteten, organ transplantation och flikkirurgi trombos är vanliga orsaker till komplikationer. Mikrovaskulär trombos i synnerhet orsakar ofta obotliga skador på grund av bristen på kliniska symptom. Likaså spelar mikrovaskulär trombos en avgörande regel i flera sjukdomar, inklusive trombotisk trombocytopen purpura, sepsis, disseminerad intravaskulär koagulation, antifosfolipidsyndrom och kronisk venös insufficiens, bland annat.

Flera nya läkemedel för behandling och förebyggande av blodpropp har utvecklats under de senaste åren, men trombocythämmande läkemedel och antikoagulantia har fortfarande biverkningar, brist antagonister och har långvariga effekter. Dessa brister leder till problem i akut medicinsk vård. Sålunda behövs mer forskning för att avslöja de komplexa processer som sker under trombos, vilket knappast kan simuleras in vitro.

Den hårlösa SKH1-Hr ^HR mus upptäcktes 1926 i en djurpark i London.På grund av en gendefekt på kromosom 14, förlorar djuret pälsen efter postnatal dag 10. Detta gör den väl vaskulariserad ytteröra tillgänglig för intravital mikroskopi av kärlen. Den genomsnittliga tjockleken av örat är 300 um. Det består av två skikt av dermis, som skiljs åt av brosk. På den konvexa dorsala sidan av brosket, 3 kärlknippena in i örsnibben. Apikala kärl bågar och basala shuntar ansluta tre buntar. De venoler har diametrar mellan 200 ^ m (basal) och 10 | j, m (apikala). Finmaskigt kapillärer omger tomma hårsäckar ^2. Anatomi hårlösa SKH1-Hr ^HR musen gör öronmusslan ett kraftfullt och kostnadseffektivt modell för trombos forskning.

Protocol

Alla in vivo experiment (7221.3-1-006 / 15) genomfördes i enlighet med den tyska lagstiftningen om skydd av djur och NIH Guide för skötsel och användning av försöksdjur (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council). 1. Allmän djurhållningen Utföra experimenten med manliga SKH1-hr hr möss åldern 4 till 6 veckor. Använda djur med en vikt mellan 20 och 25 g. Hålla djuren i en patogenfri anläggning och under standardi…

Representative Results

Effekter av Cannabinoid Behandling på trombogenes Efter injektion av 0,05 ml av FITC-dextran, leder fototoxisk tromb induktion till en endotel lesion och bildandet av en parietal plättplugg (fig 2 och 3). I föreliggande studie, tromb induktion efter ip-injektion av cannabinoider (5 mg / kg kroppsvikt) eller vehikel resulterade i en trombotisk kärlocklusion i alla venoler (Figur 4).</s…

Discussion

Det finns flera viktiga steg för en framgångsrik tromb induktion i örsnibben av SKH1-hr ^hr möss. För felsökning är de respektive stegen i protokollet indikeras i parentes.

Examination förhållandena är idealiska i unga djur vid en ålder av 4 – 6 veckor och med låg förhorning av epidermis. I äldre djur, är kvaliteten på visualisering av kärlen värre och mindre jämförbar grund av den högre avståndet mellan hudytan och målsekärlen (steg 1,1).

<p class="jove…

Materials

SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20x/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63x/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
plasters	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14,5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0,5 cm high plane