Optimerad Analys av<em> In Vivo</em> och<em> In Vitro</em> Leversteatos
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Fetma är ett växande hälsoproblem i utvecklade länder och utvecklingsländer. Det har rapporterats att vara en av de samtidiga sjukdomar som ofta förknippas med alkoholfria fettlever (NAFLD), med en prevalens mellan 30 och 100 procent i NAFLD patienter 1. Grund av den starka korrelationen mellan fettlever och fetma, är dietframkallad fetma (DIO) musmodeller används i stor utsträckning för att studera de komplexa molekylära mekanismer som är förknippade med utvecklingen av NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatos är det tidigaste stadiet av NAFLD, och det kan utvecklas till nonalcoholic steatohepatitis (NASH), cirros, och i slutändan, levercancer 7. Därför är det övergripande målet med denna metod för att generera djur- och cellmodeller av lever steatotic villkor och prOvide detaljerade protokoll för effektiv och korrekt lipid mätning. Dessa modeller och mätningar är också användbara för undersökning av andra metabola störningar, såsom insulinresistens och typ 2 diabetes.
Fetma har identifierats att vara en av de viktigaste riskfaktorerna för NAFLD, en fettrik är hög sackaros diet (HFHS) som imiterar västerländsk fettrik kost som används för att framkalla fetma hos möss. Därefter kan bedömas graden av leversteatos med olika metoder. Först, kroppsvikt och kroppssammansättning analys med kärnmagnetisk resonans (NMR) visar fettinlagring under matdags. Fettmassan och mager massa kan kvantifieras i ett icke-invasivt och i realtid sätt.
Dessutom är magnetisk resonanstomografi (MRI) som används för att visa både hela kroppen och levern distribution av fett. Den gråskala Signalen från MRI-analys, kan omvandlas till ett läsbart pseudofärgbild, och intensiteten avgråskala och färg är hemi-kvantifierbara. Denna teknik ger unika fördelar för mätning av lipid-ackumulering i levande djur. För det andra är histologisk analys av levern den mest använda metoden för att bestämma leversteatos. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning ger histologiska information, såsom hepatocyte morfologi och makrofag infiltration, medan Oil Red O färgning visar storleken och läget för lipiddropparna i hepatocyter. För det tredje, är analysen av fetthalten med användning av kloroform / metanol extraktion en noggrann och kvantitativ mätning av lever lipider. Totala triglycerider och kolesterolnivåer kan mätas med biokemiska metoder. Viktigt kan lipidextraktion analys och Oil Red O färgning också användas i genetiskt manipulerade eller farmaceutiskt behandlade leverceller.
Fördelen med föreliggande förfarande är dess användning av flera optimerade metoder för att generera lever steatotic modelleroch att övergripande karakterisera fenotyper både in vivo och in vitro. modeller DIO möss kan sammanfatta de patologi och metaboliska fenotyper av mänsklig fettlever. Andra metaboliska parametrar hos människa kan replikeras i denna modell samt 8. Genereringen av steatotic hepatocyt modell som svar på hög glukos plus insulin är effektiv, användbar och övervinner begränsningen av kostsamma och tidskrävande mus arbete. Sammantaget ger dessa metoder är tillräckliga och väsentliga för att studera lever lipid dysfunktion och insulinresistens under närings överbelastning.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD är en serie av progressiva leversjukdomar som är förknippade med metabolt syndrom, fetma, insulinresistens, eller typ 2 diabetes mellitus (T2DM) 11. Det kännetecknande för NAFLD är steatosis, ansamling av lipid i hepatocyter. Här är ett spektrum av metoder som presenteras för att karakterisera fenotyper och parametrar för leversteatos hjälp DIO möss och mus primära hepatocyter. Detta förfarande kan vara till hjälp för att belysa molekylära mekanismer NAFLD och andra metabol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
