Denna uppsats förklarar tillämpningen av fluorescerande avbildning med en aktiverbar optisk avbildningssond att visualisera aktiviteten av viktiga matrismetalloproteinaser in vivo i två olika experimentella modeller av inflammation.
I detta dokument beskrivs en icke-invasiv metod för bildbehandling av matrismetalloproteinaser (MMP) -aktivitet med en aktiverbar fluorescerande prob, via in vivo- fluorescensoptisk bildbehandling (OI), i två olika musmodeller av inflammation: en reumatoid artrit (RA) och en kontakt Överkänslighetsreaktion (CHR) -modell. Ljus med våglängd i det nära infraröda (NIR) fönstret (650-950 nm) möjliggör en djupare vävnadspenetration och minimal signalabsorption jämfört med våglängder under 650 nm. De stora fördelarna med fluorescens OI är att det är billigt, snabbt och enkelt att implementera i olika djurmodeller.
Aktiverbara fluorescerande prober är optiskt tysta i deras inaktiverade tillstånd men blir mycket fluorescerande när de aktiveras av ett proteas. Aktiverade MMP leder till destruktion av vävnad och spelar en viktig roll för sjukdomsprogression vid fördröjd typ överkänslighetsreaktioner (DTHR), såsom RA och CHR. Dessutom är MMP: ernyckel proteaser för brosk och bennedbrytning och induceras av makrofager, fibroblaster och kondrocyter som svar på proinflammatoriska cytokiner. Här använder vi en sond som aktiveras av de viktigaste MMP som MMP-2, -3, -9 och -13 och beskriva ett avbildningsprotokoll för nära infraröd fluorescens OI av MMP-aktivitet i RA och kontrollmöss 6 dagar efter sjukdomsinduktion samt såsom i möss med akut (1x utmaning) och kronisk (5x utmaning) CHR på höger öra jämfört med friska öron.
Autoimmuna sjukdomar såsom reumatoid artrit (RA) eller psoriasis vulgaris är graderade såsom fördröjd typ hypersensitivitetsreaktioner (DTHRs). En RA är en vanlig autoimmun sjukdom som kännetecknas av erosiv synovit och leddestruktion. 2 Inflammerade artritiska leder visar infiltration och proliferation av inflammatoriska celler, en ökad expression av pro-inflammatoriska celler som leder till pannus-bildning, brosk och ben graven. 3, 4 Klyvningen av extracellulära matrismolekyler, såsom kollagen av matrismetalloproteinaser (MMP), är väsentlig för vävnadsomvandling och angiogenes och orsakar vävnadsförstörelse. 5, 6 Kontakt överkänslighetsreaktioner (CHR) kännetecknas av aggregering av neutrofiler leder till en oxidativ burst. 7 I likhet med RA, MMP i CHR är involved i vävnadsomvandling, cellmigration och angiogenes i syfte att upprätta kronisk inflammation.
Att undersöka RA, var glukos-6-fosfatisomeras (GPI) -serum injektion musmodell användes. 8 Serum från transgena möss K / BxN innehållande antikroppar mot GPI, injicerades i naiva BALB / c-möss efter vilket reumatisk inflammation började utveckla inom 24 h med ett maximum av ankelsvullnad på dag 6 efter GPI-seruminjektion (se 1,1). Att analysera kronisk CHR, var C57BL / 6-möss sensibiliserades med trinitrochlorobenzene (TNCB) på buken. Höger öra utmanades upp till 5 gånger med början en vecka efter sensibilisering (se även 1.1 och 1.2).
Noninvasive litet djur OI är en teknik baserad på utredning av fluorescent-, chemiluminescent- och bioluminescerande-signaler, som huvudsakligen används i preklinisk forskning in vivo. Den förvärvade semikvantitativ data som ger insikter i MolecUlar mekanismer i organen och vävnaderna hos såväl friska som sjuka experimentella djurmodeller, och möjliggör longitudinella uppföljningsmått ( t.ex. att utvärdera terapeutiska responsprofiler in vivo ). En stor fördel med longitudinella studier är minskningen av djurtal eftersom samma djur kan mätas i uppföljningsstudier vid flera tidpunkter istället för att använda olika möss per tidpunkt. Upplösningen av OI möjliggör detaljerad funktionell bildbehandling av organ och till och med mindre vävnadsstrukturer i försöksdjur.
Användningen av specifika excitations- och emissionsfilter med ett smalt transmissionsspektrum, ett skydd mot spridda ljus genom en ljusbeständig "mörk låda" och en känslig laddad kopplad enhet (CCD) -kamera som kyls i många enheter ner till -70 ° C , Möjliggör mycket specifika och känsliga mätningar av fluorescenssignaler.
Genom att använda fluorescerande medel med excitations- ochUtsläppsspektra i det nära infraröda fluorescensfönstret (650-950 nm), signal-till-brus-förhållandena kan förbättras signifikant. Det nära infraröda fluorescensfönstret kännetecknas av en relativt låg absorption av signalen med hemoglobin och vatten såväl som en låg bakgrunds-auto-fluorescens. 9 Detta möjliggör ett penetrationsdjup på upp till 2 cm i vävnaden hos små djur. OI-sonder kan adressera ett mål direkt ( t.ex. av en fluorescensmärkt antikropp) eller kan aktiveras i målvävnaden ( t.ex. genom proteaser). Aktiverbara OI-sonder är optiskt tysta i sin inaktiverade form på grund av Förster-resonansenergiöverföringen (FRET) till en släckningsdel, vilken överför excitationsenergin inuti molekylen till en annan domän. Om färgämnet klyvs (med ett proteas till exempel) överförs energin inte längre inom molekylen och en fluorescerande signal kan detekteras av OI. Detta möjliggör konstruktion av OI-sonder med hög specifikitetY för tydliga biologiska processer och utmärkt signal-till-brus-förhållanden.
Följande protokoll förklarar i detalj preparatet av djuren, OI-mätningarna med användning av en aktiverbar OI-sond till bild MMP-2, -3, -9 och -13-aktivitet in vivo och två experimentella modeller av inflammation (RA, CHR).
OI är ett mycket användbart, snabbt och billigt verktyg för icke-invasiv in vivo molekylär bildbehandling i preklinisk forskning. En särskild styrka hos OI är förmågan att övervaka mycket dynamiska processer som inflammatoriska reaktioner. Dessutom tillåter OI att man följer en sjukdomsförlopp under en längre tidsperiod, från dag till vecka.
OI har flera fördelar jämfört med andra in vivo bildhanteringsmodaliteter såsom positron-emission tomografi (PET) el…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Daniel Bukala, Natalie Altmeyer och Funda Cay för utmärkt teknisk support. Vi tackar Jonathan Cotton, Greg Bowden och Paul Soubiran för redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av Werner Siemens-stiftelsen och Medicinska fakulteten vid Eberhard Karls universitet Tübingen ( '' Promotionskolleg '') och av DFG genom CRC 156 (projekt C3).
Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
Heparin | Sintetica | 6093089 | |
High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |