Nicht-invasiv<em> In vivo</em> Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers
Summary
Dieses Papier beschreibt die Anwendung von Fluoreszenz – Bildgebung einer aktivierbare optische Abbildungssonde mit der in vivo Aktivität von Schlüsseln Matrixmetalloproteinasen in zwei verschiedenen Versuchsmodellen der Entzündung zu visualisieren.
Abstract
Dieses Papier beschreibt ein nicht-invasives Verfahren zur Abbildung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -Aktivität durch eine aktivierbare Fluoreszenzsonde über in vivo Fluoreszenz-optische Bildgebung (OI) in zwei verschiedenen Mausmodellen der Entzündung: eine rheumatoide Arthritis (RA) und einen Kontakt Hypersensitivitätsreaktion (CHR) Modell. Licht mit einer Wellenlänge im nahen Infrarot (NIR) Fenster (650 – 950 nm) ermöglicht eine tiefere Gewebepenetration und minimale Signalabsorption im Vergleich zu Wellenlängen unter 650 nm. Die großen Vorteile mit Fluoreszenz OI ist, dass es billig, schnell und einfach in verschiedenen Tiermodellen zu implementieren ist.
Aktivierbare Fluoreszenzsonden sind in ihren inaktivierten Zuständen optisch leise, werden aber bei der Aktivierung durch eine Protease stark fluoreszierend. Aktivierte MMPs führen zur Gewebezerstörung und spielen eine wichtige Rolle für die Progression von Krankheiten bei verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) wie RA und CHR. Darüber hinaus sind MMPsDer Schlüssel Proteasen für Knorpel- und Knochenabbau und wird von Makrophagen, Fibroblasten und Chondrozyten in Reaktion auf proinflammatorische Cytokine induziert. Hier verwenden wir eine Sonde, die durch die Schlüssel MMPs wie MMP-2 aktiviert wird, -3, -9 und -13, und ein Bildgebungsprotokoll für Nah-Infrarot-Fluoreszenz OI der MMP-Aktivität in RA und Kontroll-Mäuse 6 Tage nach der Krankheitsinduktion beschreiben und wie bei Mäusen mit akuter (1x Herausforderung) und chronische (5x Herausforderung) CHR am rechten Ohr im Vergleich zu gesunden Ohren.
Introduction
Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis (RA) oder Psoriasis vulgaris werden als verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) eingestuft. 1 RA ist eine gemeinsame Autoimmunerkrankung, die durch erosive Synovitis und Gelenkzerstörung gekennzeichnet ist. 2 Inflamed arthritische Gelenke zeigen Infiltration und Proliferation von entzündlichen Zellen, eine erhöhte Expression von entzündungshemmenden Zellen, die zu Pannusbildung, Knorpel und Knochenzerstörungen führen. 3 , 4 Die Spaltung von extrazellulären Matrixmolekülen wie Kollagen durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) ist für die Gewebeumwandlung und Angiogenese essentiell und verursacht Gewebezerstörungen. 5 , 6 Kontaktüberempfindlichkeitsreaktionen (CHR) zeichnen sich durch Aggregation von Neutrophilen aus, die zu einem oxidativen Burst führen. 7 Ähnlich wie bei RA sind MMPs in CHR involviertved in Gewebeumwandlung, Zellmigration und Angiogenese, um eine chronische Entzündung zu etablieren.
Um zu untersuchen, RA, die Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) -Serum Injektionsmausmodell verwendet wurde. 8 Serum aus transgenen K / B × N – Mäuse – Antikörpern gegen GPI enthält, wurde in naiven BALB / c – Mäuse injiziert , nach der rheumatischen Entzündungen innerhalb von 24 h mit maximal Knöchelschwellung am Tag 6 nach der GPI-Seruminjektion (siehe 1.1) zu entwickeln begann. chronischen CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit Trinitrochlorbenzol (TNCB) sensibilisiert auf dem Bauch zu analysieren. Das rechte Ohr wurde auf 5 mal beginnend 1 Woche nach der Sensibilisierung in Frage gestellt (siehe auch 1.1 und 1.2).
Noninvasive Kleintier OI ist eine Technik , basierend auf die di – vivo – Untersuchung von Fluoreszenz-, chemiluminescent- und Biolumineszenz-Signalen, die in der präklinischen Forschung hauptsächlich verwendet werden. Die erworbenen semi-quantitativen Daten geben Einblicke in die molecular Mechanismen in den Organen und Geweben von gesunden als auch erkrankten experimentellen Tiermodellen und Längs ermöglicht Messungen verfolgen (zB therapeutische Reaktion Profile in vivo zu bewerten). Ein großer Vorteil der Langzeitstudien ist die Verringerung der Anzahl der Tiere, wie die gleichen Tiere können in Folgestudien zu mehreren Zeitpunkten anstelle der Verwendung von verschiedenen Mäusen pro Zeitpunkt gemessen werden. Die Auflösung von OI ermöglicht eine detaillierte funktionelle Bildgebung von Organen und sogar kleinere Gewebestrukturen bei Versuchstieren.
Die Verwendung spezieller Anregungs- und Emissionsfilter mit einem schmalen Transmissionsspektrum, ein Schutz gegen Streulicht durch eine lichtundurchlässigen „Dunkelkammer“ sowie ein sensitiver Charged-Coupled Device (CCD) -Kamera, die in vielen Geräten bis -70 ° C abgekühlt wird, ermöglicht hochspezifische und empfindliche Messungen von Fluoreszenzsignalen.
Durch die Verwendung von Fluoreszenzmitteln mit Anregungs- undEmissionsspektren im Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster (650 – 950 nm) können Signal-Rausch-Verhältnisse deutlich verbessert werden. Das Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster zeichnet sich durch eine relativ geringe Absorption des Signals durch Hämoglobin und Wasser sowie eine niedrige Hintergrund-Auto-Fluoreszenz aus. 9 Dies ermöglicht eine Eindringtiefe von bis zu 2 cm im Gewebe von kleinen Tieren. OI-Sonden können direkt ein Ziel adressieren ( zB durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper) oder im Zielgewebe ( zB durch Proteasen) aktiviert werden. Aktivierbare OI-Sonden sind aufgrund ihrer Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) in ihrer inaktivierten Form optisch schweigend zu einer Quench-Einheit, die die Anregungsenergie im Molekül in eine andere Domäne überträgt. Wenn der Farbstoff gespalten wird (z. B. durch eine Protease), wird die Energie nicht mehr innerhalb des Moleküls übertragen und ein Fluoreszenzsignal kann von OI detektiert werden. Dies ermöglicht die Konstruktion von OI-Sonden mit hohem spezifischemY für unterschiedliche biologische Prozesse und ausgezeichnete Signal-Rausch-Verhältnisse.
Das folgende Protokoll erläutert im Detail die Vorbereitung der Tiere, die OI-Messungen unter Verwendung einer aktivierbaren OI-Sonde zur Abbildung der MMP-2, -3, -9 und -13-Aktivität in vivo und zwei experimentelle Modelle der Entzündung (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI ist ein sehr nützliches, schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die nicht-invasive in vivo molekulare Bildgebung in der präklinischen Forschung. Eine besondere Stärke von OI ist die Fähigkeit, hochdynamische Prozesse wie entzündliche Reaktionen zu überwachen. Darüber hinaus erlaubt OI, den Kurs einer Krankheit für einen längeren Zeitraum zu verfolgen, von Tagen bis Wochen.
OI hat mehrere Vorteile gegenüber anderen in vivo -Bildgebungsmodalitäten wie Posi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Daniel Bukala, Natalie Altmeyer und Funda Cay für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Jonathan Cotton, Greg Bowden und Paul Soubiran das Manuskript für die Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung und der Medizinischen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen ( ‚‘ Promotions ‚‘) und von der DFG durch den CRC 156 (Projekt C3) unterstützt.
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
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