استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل
Summary
واستغلت الكريستال السائل جسيمات متناهية الصغر (LCNP) nanocarrier كوسيلة لإيصال تسيطر عليها شحنة مسعور إلى غشاء البلازما من الخلايا الحية.
Abstract
والتسليم المراقب وكلاء المخدرات / التصوير للخلايا هو أمر حاسم لتطوير علاجات ولدراسة العمليات الإشارات الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت النانوية (NPS) وعد كبير في تطوير نظم تسليم مثل هذه. هنا، وقد تم استخدام الكريستال السائل NP (LCNP) نظام تسليم المستندة للالتسليم المراقب صبغة غير قابلة للذوبان في الماء، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو)، من داخل نواة NP إلى المنطقة مسعور من البلازما غشاء طبقة ثنائية. خلال توليفة من مصادر القدرة النووية، تأسست الصبغة بكفاءة في صلب LCNP مسعور، وهو ما أكدته التحاليل الطيفية متعددة. الإقتران من مضاد للفيروسات الكولسترول مشتق إلى السطح NP (ديو-LCNP-PEG-تشول) تمكين الربط من مصادر القدرة النووية محملة صبغ إلى غشاء البلازما في كلوة 293T / 17 الخلايا. ليزر المسح المجهري متحد البؤر وفورستر نقل الطاقة الرنين وقت حل (الحنق) التصوير وأكد الممرإيف هروب رأس المال من ديو من صميم LCNP واندماجها طبقة ثنائية غشاء البلازما. وأخيرا، تقديم ديو باعتباره LCNP-PEG-تشول الموهن السمسة ديو. شكل NP ديو عرضت ~ 30-40٪ أقل سمية مقارنة ديو تسليمها خالية من حل الجزء الأكبر. يوضح هذا النهج فائدة منصة LCNP كما طريقة فعالة لإيصال غشاء محددة وتعديل من الشحنات الجزيئية مسعور.
Introduction
منذ ظهور تفاعل المواد النانوية (المواد ≤100 نانومتر في بعد واحد على الأقل) مع الخلايا الحية، وكان هدف الاستمرار في الاستفادة من خصائص فريدة من نوعها تعتمد على حجم الجسيمات النانوية (NPS) لمختلف التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الخلايا والأنسجة وصفها / التصوير (على حد سواء في التجارب المختبرية والحية)، والاستشعار في الوقت الحقيقي، والتسليم المراقب للمخدرات وغيرها من الشحنات 1. ومن أمثلة هذه الخصائص NP ذات الصلة انبعاث تعتمد على حجم البلورات النانوية أشباه الموصلات (النقاط الكمومية، نقاط الكمية)؛ خصائص ضوئي؛ ضوحراري من جزيئات الذهب. قدرة التحميل كبيرة من جوهر مائي من الجسيمات الشحمية. والتوصيل الباليستية من المتآصلة الكربون، مثل الأنابيب النانوية الكربونية جدار واحد والجرافين.
وفي الآونة الأخيرة، ظهرت فائدة كبيرة في استخدام مصادر الطاقة النووية للتعديل تسيطر المخدرات والبضائع الأخرى، مثل التباين / التصوير لأيها السادة. هنا، فإن الأساس المنطقي هو أن يعزز إلى حد كبير / تحسين الذوبان الكلي، جرعة تسليمها، وقت الدورة الدموية، وإزالة في نهاية المطاف من شحن المخدرات من خلال تقديم أنها صيغة NP. وجاء ذلك ليكون المعروفة باسم تسليم المخدرات بوساطة NP (NMDD)، وهناك حاليا سبع وافقت ادارة الاغذية والعقاقير التركيبات الدوائية NP لاستخدامها في عيادة لعلاج مختلف أنواع السرطان ومئات أخرى في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. في جوهرها، والهدف من ذلك هو "تحقيق المزيد بموارد أقل." وهذا هو، لاستخدام NP كما سقالة لتقديم المزيد من المخدرات مع الإدارات الجرعات أقل من خلال الاستفادة من مساحة كبيرة: حجم (على سبيل المثال، والجسيمات الصلبة، مثل نقاط الكمية وأكاسيد المعادن) من مصادر القدرة النووية أو حجم الداخلية كبيرة من أجل تحميل حمولات شحن كبيرة (على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية أو المذيلات). والغرض هنا هو للحد من ضرورة لعدة الجرعات تسليمها بشكل منتظم وفي الوقت نفسه تعزيز الاستقرار المائي وتعزيز الدورة الدموية، وخاصة بالنسبة للتحدي الشحنات المخدرات مسعور أنه في حين فعالة للغاية، القابلة للذوبان لماما في الأوساط المائية.
وهكذا، كان الهدف من العمل الموصوفة هنا لتحديد إمكانية استخدام رواية NP سقالة للتسليم محددة ورقابة من الشحنات مسعور إلى محبة للدهون طبقة ثنائية غشاء البلازما. كان الدافع للعمل ذوبان محدود الكامنة وصعوبة في إيصال الجزيئات الكارهة للماء إلى خلايا من الأوساط المائية. عادة، وتسليم هذه الجزيئات الكارهة للماء يتطلب استخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، دمس) أو السطحي محبة للجهتين (على سبيل المثال، Poloxamers)، التي يمكن أن تكون سامة وتسوية الخلايا والأنسجة الحيوية 2، أو ناقلات مذيلة، الذي يمكن أن يكون محدودا تحميل الداخلي القدرات. كان الناقل NP اختار هنا رواية الكريستال السائل NP (LCNP) صياغة وضعت من قبل 3 والتي أثبتت في السابق لتحقيق ~ 40 أضعاف التحسن في كفاءة دوكسوروبيسين المخدرات المضادة للسرطان في الخلايا المستزرعة 4.
في العمل الموصوفة هنا، كانت البضائع تمثيلية اختيار الجهدية غشاء صبغ، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو). ديو هو صبغة غير قابلة للذوبان المياه التي استخدمت لتقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء في المعيشة والخلايا العصبية ثابتة، غشاء القياسات المحتملة، وغشاء العام وسم 5، 6، 7، 8، 9. نظرا لطبيعتها مسعور، وعادة ما أضاف ديو مباشرة إلى الطبقات الوحيدة أو أنسجة الخلايا في شكل بلوري 10، أو المحتضنة ذلك بتركيزات عالية جدا (~ 1-20 ميكرون) بعد التخفيف من محلول المخزون تركيز 11 و 12.
محتوى "> هنا، كان نهج استخدام للمنصة LCNP، وأدرجت NP متعدد الوظائف الذي الداخلي الأساسي هو مسعور تماما والتي السطح هو ماء وقابلة للbioconjugation في وقت واحد، وسيلة لتسليم ديو. ديو في صلب LCNP خلال التوليف ، وسطح NP ثم يتم functionalized مع الكوليسترول شاردة مضاد للفيروسات لتعزيز غشاء ملزمة للفرقة ديو-LCNP إلى غشاء البلازما. أدى هذا النهج في نظام التسليم التي تقسم ديو في غشاء البلازما مع قدر أكبر من الدقة والإقامة الغشاء الوقت من شكل خال من ديو تسليم من حل الجزء الأكبر (ديو مجاني). وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الطريقة أن تسليم بوساطة LCNP ديو ينظم بشكل كبير ويدفع معدل تقسيم معين من الصبغة في محبة للدهون طبقة ثنائية الغشاء البلازمي، وهذا هو تحقق مع الحد بصورة متزامنة والسمية الخلوية للخال من المخدرات التي كتبها ~ 40٪ عن طريق تقديم أنها صيغة LCNP. <p clالحمار = "jove_content"> ومن المتوقع أن المنهجية الواردة في هذه الوثيقة ستكون قوية تقنية تمكن للباحثين الذين ينطوي أو يتطلب تسليم الخلوي من الشحنات مسعور للغاية القابلة للذوبان لماما أو غير قابلة للذوبان تماما في محلول مائي العمل.Protocol
Representative Results
Discussion
هدف استمرار NMDD هو استهداف للرقابة وتسليم التركيبات الدوائية إلى الخلايا والأنسجة، جنبا إلى جنب مع متزامنة تحسين فعالية الدواء. واحد فئة معينة من جزيئات الدواء التي قد يشكلها هذا تحديا كبيرا هو مسعور وكلاء الأدوية / التصوير التي لديها لماما دون الذوبان في الوسط المائ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل برنامج تمويل قاعدة المختبر الوطني المرجعي (وحدة العمل MA041-06-41-4943). معتمد على من قبل المجلس الوطني للبحوث ما بعد الدكتوراه بحوث زمالة.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
Riferimenti
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochimica. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
