Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger
Summary
Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.
Abstract
Die kontrollierte Abgabe von Arzneimittel / Abbildungsmittel für Zellen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapeutika und für die Untersuchung von zellulären Signalprozessen. Vor kurzem Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend sind in der Entwicklung solcher Abgabesysteme gezeigt. Hierbei wird ein Flüssigkristall NP (LCNP) basierende Verabreichungssystem wurde für die kontrollierte Abgabe eines wasserunlöslichen Farbstoff eingesetzt, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO), von innerhalb des NP Kern zu den hydrophoben Bereich eines Plasma Membran-Doppelschicht. Während der Synthese der NPs wurde der Farbstoff effizient in den hydrophoben Kern LCNP eingebaut, wie bestätigt durch mehrere spektroskopische Analysen. Konjugation eines PEGylierten Cholesterinderivat zur NP Oberfläche (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiviert die Bindung der farbstoffbeladenen NPs an die Plasmamembran in HEK 293T / 17-Zellen. Zeitaufgelöste Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung bestätigte den Passive Efflux von DiO vom LCNP Kern und seine Insertion in die Plasmamembran-Doppelschicht. Schließlich abgeschwächt die Lieferung der OVI als LCNP-PEG-Chol die Zytotoxizität von DiO; die NP Form Dio ausgestellt ~ 30-40% geringere Toxizität im Vergleich zu DiO frei von Massenlösung geliefert. Dieser Ansatz zeigt die Nützlichkeit der LCNP Plattform als effiziente Modalität für die membranspezifische Abgabe und Modulation der hydrophoben Molekül cargos.
Introduction
Seit dem Aufkommen der Schnittstelle Nanomaterialien (Materialien ≤100 nm in mindestens einer Dimension) mit lebenden Zellen, ein kontinuierliches Ziel wurde für verschiedene Anwendungen Vorteile der einzigartigen größenabhängigen Eigenschaften von Nanopartikeln (NPs) zu nehmen. Diese Anwendungen umfassen die Zell- und Gewebemarkierungs / imaging (sowohl in vitro als auch in vivo), Echtzeiterfassung, und die gesteuerte Abgabe von Arzneimitteln und anderen cargos 1. Beispiele für solche relevanten NP Eigenschaften umfassen die größenabhängige Emission von Halbleiter-Nanokristallen (Quantum Dots, QD); die Eigenschaften Lichtwärmeumsetzmaterial von Gold-Nanopartikeln; die große Ladekapazität des wässrigen Kern von Liposomen; und die ballistische Leitfähigkeit von Kohlenstoffallotrope, wie einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphen.
In jüngerer Zeit hat großes Interesse an der Verwendung von NPs für die kontrollierte Modulation von Arzneimitteln und anderen Frachten, wie Kontrast / Abbildungs a entstandenHerren. Hier ist das Grundprinzip deutlich zu verbessern / optimieren den gesamten Löslichkeit abgegebenen Dosis, Kreislaufzeit und eventuelle Clearance des Arzneimittels Ladung durch sie als NP-Formulierung zu liefern. Dies hat sich als NP-vermittelte Arzneimittelabgabe bekannt sein (NMDD), und es gibt derzeit sieben FDA-zugelassenen NP Arzneimittel-Formulierungen für den Einsatz in der Klinik verschiedene Krebsarten und Hunderte mehr in verschiedenen Phasen der klinischen Studien zu behandeln. Im Wesentlichen ist es das Ziel, "mehr mit weniger zu erreichen;" Das heißt, das NP als Gerüst zu verwenden , um mehr Medikament mit weniger Dosierungs Verabreichungen liefern durch Ausnutzung der großen Oberflächenbereich einnehmen: Volumen (beispielsweise harte Partikel, wie QD und Metalloxiden) von NPs oder deren großen Innenvolumen zum Beladen große Fracht Nutzlasten (zB Liposomen oder Mizellen). Der Zweck ist hier die Notwendigkeit für mehrere systemisch zugeDosierungsSchemata zu reduzieren, während gleichzeitig die wässrige Stabilität und eine verbesserte Durchblutung fördern, insbesondere füranspruchsvolle hydrophobe Arzneimittel cargos, die zwar hochwirksam, in wässrigen Medien schwer löslich sind.
Somit war das Ziel der hierin beschriebene Arbeit, die Lebensfähigkeit der Verwendung eines neuen NP-Gerüst für die spezifische und gesteuerte Abgabe von hydrophoben cargos dem lipophilen Plasmamembran-Doppelschicht zu bestimmen. Die Motivation für die Arbeit war die inhärente begrenzte Löslichkeit und die Schwierigkeit bei der Bereitstellung von hydrophoben Molekülen an Zellen aus wäßrigen Medien. Typischerweise erfordert die Lieferung solcher hydrophoben Molekülen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln (beispielsweise DMSO) oder amphiphile Tenside (beispielsweise Poloxamere), die 2 oder Mizelle Träger toxischen und Kompromisse Zell- und Gewebelebensfähigkeit sein kann, die interne Belastung begrenzt haben kann Kapazitäten. Der NP Träger ausgewählt hier war eine neue Flüssigkristall NP (LCNP) Formulierung zuvor 3 entwickelt und dass zuvor eine ~ 40-fache zu erreichen gezeigt worden war Verbesserung der Wirksamkeit des Antikrebsmedikament Doxorubicin in kultivierten Zellen 4.
In der hier beschriebenen Arbeiten wählte die repräsentative Ladung war die potentiometrischen Membranfarbstoff, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO). DiO ist ein wasserunlöslicher Farbstoff, der für die anterograde und retrograden Tracing in lebenden und fixierten Neuronen, Membranpotentialmessungen verwendet wurde und für die allgemeine Kennzeichnung Membran 5, 6, 7, 8, 9. Aufgrund seiner hydrophoben Natur ist DiO typischerweise direkt zu Zellmonolayern oder Geweben in einer kristallinen Form 10, oder es wird in sehr hohen Konzentrationen inkubiert (~ 1-20 uM) nach Verdünnung von einer Konzentration Stammlösung 11, 12.
content "> Hierbei ist die Vorgehensweise war die Verwendung zur LCNP Plattform, ein multifunktionales NP, dessen innere Kern vollständig hydrophob ist und deren Oberfläche gleichzeitig hydrophile und zugänglich Biokonjugation, als Abgabevehikel für DiO. DiO in die LCNP Kern während der Synthese eingearbeitet und die NP Oberfläche dann mit einem PEGylierten Cholesterin-Einheit zu fördern, um die Bindung an die Membran der OVI-LCNP Ensemble an der Plasmamembran. Dieser Ansatz führte zu einem Abgabesystem, das partitioniert Dio in die Plasmamembran mit größerer Treue und Membran Residenz funktionalisiert ist Zeit als die freie Form von DiO von Massenlösung geliefert (DIO frei). Ferner ist dieses Verfahren zeigte , dass die LCNP-vermittelte Abgabe von DiO moduliert wesentlich und treibt die Rate der spezifischen Unterteilung des Farbstoffes in die lipophile Plasmamembran bilayer. Dies ist erreicht, während gleichzeitig die Zytotoxizität des freien Arzneimittels von ~ 40% zu reduzieren, indem es als LCNP Formulierung zu liefern. <p class = "jove_content"> Es wird erwartet, dass die hier beschriebene Methode eine leistungsstarke ermöglicht Technik für die Forscher, deren Arbeit mit sein wird oder erfordert die zelluläre Bereitstellung von stark hydrophoben Frachten, die schwer löslich oder vollständig unlöslich in wässriger Lösung sind.Protocol
Representative Results
Discussion
Ein ständiges Ziel der NMDD ist die kontrollierte Ausrichtung und Abgabe von Arzneimittelformulierungen an Zellen und Geweben, bei gleichzeitiger Verbesserung der Wirksamkeit von Medikamenten kombiniert. Eine spezielle Klasse von Arzneimittelmolekülen, für die dies eine große Herausforderung gestellt hat, hydrophobe Arzneimittel / Abbildungsmittel, die schwer bis gar keine Löslichkeit in wäßrigen Medien aufweisen. Dieses Problem ist der Übergang von wirksamen Arzneimitteln aus in vitro – Zellkultursyste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der NRL Basis Förderprogramm (Arbeitseinheit MA041-06-41-4943) unterstützt. ON wird von einem National Research Council Postdoctoral Forschung Associateship unterstützt.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
Riferimenti
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