Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier
Summary
En flytende krystall nanopartikkel (LCNP) nanocarrier utnyttes som en bærer for kontrollert levering av en hydrofob last til plasmamembranen av levende celler.
Abstract
Den kontrollerte avlevering av medikament / billeddannende midler til celler som er avgjørende for utvikling av terapeutiske midler og for studiet av cellulære signaleringsprosesser. Nylig har nanopartikler (NPS) vist betydelig løftet i utviklingen av slike leveringssystemer. Her har et flytende krystall-NP (LCNP) -basert avleveringssystem blitt benyttet for kontrollert levering av en vann-uløselig fargestoff, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO), fra innsiden av NP kjernen til den hydrofobe region av en plasma membran bilaget. Under syntesen av NPS, ble fargestoffet effektivt innlemmet i den hydrofobe LCNP kjerne, som bekreftet ved flere spektroskopiske analyser. Konjugering av et PEGylert kolesterol-derivat til den NP overflate (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktivert bindingen av fargestoffbelastede NPS til plasmamembranen i HEK-293T / 17-celler. Time-løst laser scanning konfokalmikroskopi og Förster resonans energi overføring (FRET) avbildning bekreftet passive utstrømming av Dio fra LCNP kjernen og dens innsetting i plasmamembranen bilaget. Endelig levering av Dio som en LCNP-PEG-Chol svekket cytotoksisiteten til Dio; NP form av Dio utstilt ~ 30-40% mindre toksisitet sammenlignet med Dio gratis levert fra bulk løsning. Denne tilnærmingen viser anvendeligheten av den LCNP plattformen som en effektiv modalitet for membran-spesifikk avlevering og modulering av hydrofobe molekyl last.
Introduction
Siden advent av grensesnitt nanomaterialer (materialer ≤ 100 nm i minst en dimensjon) med levende celler, har en vedvarende mål vært å dra nytte av de unike størrelsesavhengige egenskaper nanopartikler (NPS) for ulike bruksområder. Disse programmene omfatter celler og vev merking / imaging (både in vitro og in vivo), real-time sensing, og kontrollert levering av legemidler og andre laster 1. Eksempler på slike relevante NP egenskaper inkluderer størrelsen avhengige utslipp av halvleder-nanokrystaller (kvanteprikker, QDS); de Photothermal egenskapene til gull nanopartikler; stor lastekapasitet av den vandige kjerne av liposomer; og ballistisk ledningsevne av karbon allotropes, slik som single-vegg karbon nanorør og graphene.
Mer nylig har betydelig interesse oppstått i bruken av NPs for kontrollert modulering av narkotika og andre laster, for eksempel kontrast / bilde enherrer. Her, er begrunnelsen for å betydelig forbedre / optimalisere den totale oppløselighet, levert dose, halveringstid i sirkulasjonen, og eventuell klaring av stoffet last ved å levere det som en NP formulering. Dette har kommet for å bli kjent som NP-mediert levering av legemidler (NMDD), og det er for tiden syv FDA-godkjente NP narkotika formuleringer for bruk i klinikken for å behandle ulike kreftformer og hundrevis mer i ulike stadier av kliniske studier. I hovedsak er målet å "oppnå mer med mindre," det vil si å bruke NP som et stillas for å levere mer stoff med færre doserings administrasjoner ved å dra nytte av det store arealet: volum (f.eks harde partikler, for eksempel QDS og metalloksider) av NPs eller deres stort innvendig volum for lasting store laste nyttelast (f.eks liposomer eller miceller). Hensikten her er å redusere behovet for flere system levert doseringsregimer, mens på samme tid å fremme vandig stabilitet og forbedret sirkulasjon, spesielt forutfordrende hydrofobe narkotika last som, mens svært effektive, er lite løselig i vandig media.
Dermed er målet for arbeidet som er beskrevet heri var å bestemme levedyktigheten ved anvendelse av en ny NP stillas for den spesifikke og regulert avgivelse av hydrofobe lastene til de lipofile plasma membran bilaget. Motivasjonen for arbeidet var den iboende begrenset løselighet og vanskeligheter i levering av hydrofobe molekyler til celler fra vandige medier. Typisk levering av slike hydrofobe molekyler krever bruk av organiske løsningsmidler (f.eks DMSO) eller amfifile overflateaktive midler (for eksempel poloksamerer), som kan være giftige og kompromiss celle og vev levedyktighet 2, eller micelle-bærere, som kan har begrenset innvendig lasting kapasiteter. NP transportøren valgt her var en roman flytende krystall NP (LCNP) formulering utviklet tidligere tre og som hadde blitt vist tidligere for å oppnå en ~ 40 ganger forbedring i effektiviteten av anticancermedikament doxorubicin i dyrkede celler 4.
I det arbeidet som er beskrevet heri, er representativ last valgt var den potensiometriske membranen fargestoff, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO). Dio er en vann-uløselig fargestoff som har blitt brukt for anterograd og retrograd tracing i stue og faste nevroner, membranpotensialmålinger, og for generell membran merking 5, 6, 7, 8, 9. På grunn av dens hydrofobe natur, Dio typisk tilsatt direkte til cellemonolagene eller vev i en krystallinsk form 10, eller det blir inkubert ved meget høye konsentrasjoner (~ 1-20 uM) etter fortynning fra en konsentrasjon stamløsning 11, 12.
innhold "> Her tilnærmingen var bruk for LCNP plattformen, er en multifunksjonell NP hvis indre kjerne er helt hydrofobe og hvis overflate er samtidig hydrofil og mottagelig for bioconjugation, som en levering kjøretøy for Dio. Dio innlemmet i LCNP kjernen under syntese og NP overflate blir deretter funksjonalisert med et PEGylert kolesterol-del for å fremme membranen binding av DIO-LCNP ensemble til plasmamembranen. Denne fremgangsmåten resulterte i et avleveringssystem som partisjonert DIO inn i plasmamembranen med større nøyaktighet og membranen oppholds tid enn fri form av Dio levert fra bulk-løsning (DIO gratis). Videre denne metoden viste at LCNP-mediert levering av Dio vesentlig modulerer og driver frekvensen av spesifikke partisjonering av fargestoff inn i lipofile plasmamembranen bilaget. dette er oppnås mens samtidig reduksjon av cytotoksisitet av det frie medikament med ~ 40% ved å levere det som en LCNP formulering. <p class = "jove_content"> Det er forventet at metoden beskrevet heri vil være en effektiv teknikk som gjør det mulig for forskere som arbeider med eller krever den cellulære levering av svært hydrofobe last som er tungt oppløselige eller helt uoppløselige i vandig oppløsning.Protocol
Representative Results
Discussion
En fortsatt målet for NMDD er kontrollert målretting og levering av narkotika formuleringer til celler og vev, kombinert med samtidig forbedret legemidlets effekt. En spesiell klasse av narkotika molekyler som dette har utgjort en betydelig utfordring er hydrofobe stoffer / bilde agenter som har sparsomt til ingen oppløselighet i vandige media. Dette problemet har plaget overgangen av potente legemidler fra in vitro-cellekultursystemer for å klinisk setting, og har resultert i en rekke lovende medikamentmol…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NRL grunnfinansiering Program (Work Unit MA041-06-41-4943). PÅ er støttet av en National Research Council postdoc Associateship.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
Riferimenti
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochimica. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
