İndüklenebilir T7 RNA Polimeraz aracılı Çok Boylu İfade Sistemi, pMGX
Summary
Bu çalışma, pMGX plazmid sistemini kullanarak Escherichia coli'de tek bir plasmidden çoklu genlerin T7 aracılı co-ekspresyonu için yöntemleri açıklamaktadır.
Abstract
Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, sentetik biyoloji, protein-protein kompleksleri ve biyosentetik yolların belirlenmesi ve işlenmesi için gittikçe zorunludur. Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimerazın kontrolü altında multigen sentetik operonların oluşturulması için oldukça etkili bir sistemin kullanımı anlatılmıştır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Burada, hem ampisilin hem de kanamisin direnci seçilebilir markeri (A ve K) olan ve ya bir N-terminal hekzahistidin'e sahip olan ya da olmayan bir dizi dört ilgili vektör, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K ve pMGX-his Etiket (onun) ifşa edilmektedir. Bu vektör sistemi kullanılarak sentetik operonların inşası için ayrıntılı protokoller, beş gen ihtiva eden bir pMGX tabanlı sistemin Escherichia coli'de beş şifrelenmiş proteinin her birinin üretilmesi için kolayca oluşturulabileceğini ve kullanılan olabileceğini gösteren karşılık gelen verilerle birlikte sağlanmaktadır. Bu sistEm ve protokolü, araştırmacıların E. coli'deki karmaşık çok bileşenli modülleri ve yolakları rutin olarak ifade etmelerini sağlar.
Introduction
Birden fazla proteinin birlikte ekspresyonu, özellikle sentetik biyoloji uygulamalarında, birden fazla fonksiyonel modülün ifade edilmesi gerektiği durumlarda giderek önemlidir; Protein-protein kompleksleri üzerinde çalışırken, ekspresyon ve fonksiyonun sık sık birlikte ifade etmesini gerektirir 2 , 3 ; Ve patolojideki her bir genin 4 , 5 , 6 , 7 , 8 olarak ifade edilmesi gereken biyosentetik yolları karakterize etme ve harekete geçirme. Özellikle konakçı organizma Escherichia coli , laboratuvar rekombinant protein ekspresyonu için çalışma atında, birlikte ifade için bir takım sistemler geliştirilmiştir. Örneğin, farklı seçilebilir işaretleyicilere sahip birden fazla plazmid, farklı ex miktarları kullanılarak bireysel proteinleri ifade etmek için kullanılabilir Baskı vektörleri 10 , 11 . Çoklu protein ekspresyonu için tekli plazmid sistemleri, her bir gen 10 , 12'nin ekspresyonunu kontrol etmek için çoklu promotörleri kullandı; Sentetik operanlar, burada birden fazla gen tek bir kopyada kodlanmıştır 2 , 13 ; Veya, bazı durumlarda, nihai olarak proteolitik olarak işlenmiş, ilgilenilen istenen proteinleri üreten bir polipeptidi kodlayan tek bir gen.
Şekil 1: Bir polisistronik vektörün yapımını gösteren pMGX iş akışı. PMGX sistemi, indüklenebilir bir T7 promoterinin kontrolü altındaki sentetik operonların oluşturulması için esnek ve kullanımı kolay bir strateji sağlar.E-posta: e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Bu yazıda, indiglenebilir bir T7 RNA polimeraz ( Şekil 1 ) kontrolü altında multijene sentetik operonların inşası için oldukça etkili bir sistemin kullanımı açıklanmaktadır. Bu sistem birçok genin aynı anda bir plazmitten eksprese edilmesini sağlar. Başlangıçta pKH22 olarak adlandırılan, 6 , 7 , 8 numaralı farklı uygulamalar için başarıyla kullanılan bir plazmid sistemini temel alır. Burada, bu plazmid seti, dört ilgili vektörü içerecek şekilde genişletilir: pMGX-A, herhangi bir C veya N-terminal etiketi içermeyen bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-hisA, bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve ampisilin direnci markörü; PMGX-K, bir ifade vektörüC veya N-terminal etiketlerini ve kanamisin direnç işaretleyicisini ölçmek; Ve bir N-terminal hekzahistidin etiketini kodlayan bir ifade vektörü ve kanamisin dirençli markör olan pMGX-hisK. Bu çalışmada, pMGX sistemi, özellikle pMGX-A kullanılarak beş gen ihtiva eden bir polisistronik vektör üretme yöntemi, her bir proteinin Escherichia coli'de başarılı bir şekilde üretilmesi ile birlikte gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birden fazla genin ortak ekspresyonu, özellikle karmaşık, multigenik metabolik yolları karakterize etme ve yeniden yapılandırmada 3 , 4 , 5 için giderek daha fazla önemlidir. PMGX sistemi E. coli rutininde 6 , 7 , 8 randevularında multijen ortak ekspresyonu yapar ve çeşitli araştırmacılar tarafından erişilebili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklendi.
Materials
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50 x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box – PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
Riferimenti
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
