Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Mohamed I. Hassan; Fern R. McSorley; Kinya Hotta; Christopher N. Boddy

doi:10.3791/55187

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetica

Inducerbart T7-RNA-polymeras-medierat multigenexpressionssystem, pMGX

Published: June 27, 2017

doi:

10.3791/55187

Mohamed I. Hassan*¹, Fern R. McSorley*¹, Kinya Hotta, Christopher N. Boddy

¹Department of Chemistry and Biomolecular Sciences,University of Ottawa, ²School of Biosciences,The University of Nottingham Malaysia Campus

Summary

Denna studie beskriver metoder för det T7-medierade samuttrycket av multipla gener från en enda plasmid i Escherichia coli med användning av pMGX-plasmidsystemet.

Abstract

Samuttryck av multipla proteiner är allt viktigare för syntetisk biologi, studier av protein-proteinkomplex och karaktärisering och utnyttjande av biosyntetiska vägar. I detta manuskript beskrivs användningen av ett högeffektivt system för konstruktion av multigene syntetiska operoner under kontroll av ett inducerbart T7-RNA-polymeras. Detta system medger att många gener kan uttryckas samtidigt från en plasmid. Här är en uppsättning av fyra besläktade vektorer, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K och pMGX-hisK, med antingen ampicillin eller kanamycinresistens-selekterbar markör (A och K) och som antingen har eller saknar en N-terminal hexahistidin Tagg (hans) beskrivs. Detaljerade protokoll för konstruktionen av syntetiska operoner som använder detta vektorsystem tillhandahålls tillsammans med motsvarande data, vilket visar att ett pMGX-baserat system innehållande fem gener lätt kan konstrueras och användas för att producera alla fem kodade proteiner i Escherichia coli . Denna systEm och protokoll gör det möjligt för forskare rutinmässigt att uttrycka komplexa multipomponentmoduler och vägar i E. coli .

Introduction

Samuttryck av multipla proteiner är allt viktigare, särskilt i syntetiska biologiska tillämpningar, där flera funktionella moduler måste uttryckas ¹ ; Vid studier av protein-proteinkomplex, där uttryck och funktion ofta kräver samuttryck ² ^, ³ ; Och att karakterisera och utnyttja biosyntetiska vägar, där varje gen i vägen måste uttryckas ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . Ett antal system har utvecklats för samuttryck, särskilt i värdorganismen Escherichia coli , arbetshästen för rekombinant proteinuttryck ⁹ för laboratorier. Till exempel kan flera plasmider med olika selekterbara markörer användas för att uttrycka individuella proteiner med användning av en mängd olika ex Pressvektorer ¹⁰ ^, ¹¹ . Enkla plasmidsystem för multipelt proteinuttryck har använt antingen multipla promotorer för att styra uttrycket av varje gen ¹⁰ ^, ¹² ; Syntetiska operoner, där flera gener kodas på ett enda transkript ² ^, ¹³ ; Eller i vissa fall en enda gen som kodar för en polypeptid som i slutändan behandlas proteolytiskt, vilket ger de önskade proteinerna av intresse ¹⁴ .

Figur 1: pMGX-arbetsflöde som visar konstruktionen av en polykistronisk vektor. PMGX-systemet ger en flexibel, lättanvänd strategi för konstruktion av syntetiska operoner under kontroll av en inducerbar T7-promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

I detta manuskript beskrivs användningen av ett högeffektivt system för konstruktion av multigene syntetiska operoner under kontroll av ett inducerbart T7-RNA-polymeras ( Figur 1 ). Detta system medger att många gener kan uttryckas samtidigt från en plasmid. Det är baserat på ett plasmidsystem, ursprungligen kallat pKH22, som har använts framgångsrikt för ett antal olika applikationer ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ . Här expanderas denna plasmidsats för att innefatta fyra besläktade vektorer: pMGX-A, en expressionsvektor som saknar några C- eller N-terminala taggar och med ampicillinresistensmarkören; PMGX-hisA, en expressionsvektor som kodar för en N-terminal hexahistidintag och med ampicillinresistensmarkören; PMGX-K, en expressionsvektor lAckingera några C- eller N-terminala taggar och med kanamycinresistensmarkören; Och pMGX-hisK, en expressionsvektor som kodar för en N-terminal hexahistidintag och med kanamycinresistensmarkören. I denna studie demonstreras förfarandet för att alstra en polykistronisk vektor innehållande fem gener som använder pMGX-systemet, specifikt pMGX-A, tillsammans med den framgångsrika framställningen av varje enskilt protein i Escherichia coli .

Protocol

1. Erhålla intressen av intresse Design syntetiska gener. Optimera en gensekvens för E. coli- uttryck. Ta bort eventuella problematiska restriktionsställen från sekvensen (AvrII, Ndel, EcoRI och Xbal). Inkorporera restriktionsställen för kloning; En 5'-NdeI-plats och en 3'-EcoRI-plats rekommenderas. Andra platser kan användas om det behövs. Hänvisa till multikloningsområdet hos den valda plasmiden ( Figur S1-</strong…

Representative Results

I denna studie var målet att samuttrycka fem proteiner från en enda plasmid. De femkodonoptimerade syntetiska genfragmenten som kodar antingen N- eller C-terminala hexahistidinmarkörer inköptes kommersiellt. De syntetiska generna amplifierades genom PCR och klonades individuellt i en PCR-trubbig vektor och sekvenserades. För att generera den polykistroniska plasmiden klonades de fem generna av intresse först i en lämplig pMGX-plasmid, pMGX-A. Figur 2 …

Discussion

Samuttryck av multipla gener är allt viktigare, särskilt vid karakterisering och rekonstituering av komplexa, multigena metaboliska vägar ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . PMGX-systemet gör multigensamekspression i E. coli rutin ⁶ ^, ⁷ ^, ⁸ och tillgänglig för olika forskare. I denna studie visade sig fem proteiner av intresse att framställas …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av Kanada: s naturvetenskapliga och tekniska forskningsråd.

Materials

Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP)	New England Biolabs	M0290S
AvrII	New England Biolabs	R0174S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
NdeI	New England Biolabs	R0111S
XbaI	New England Biolabs	R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent Technologies	600677
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
1 kb DNA ladder	New England Biolabs	N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels	Bio-Rad	456-8095
50 x TAE	Fisher Thermo Scientific	BP1332-4
Agar	Fisher Thermo Scientific	BP1423-500
Agarose	Fisher Thermo Scientific	BP160-500
Ampicilin	Sigma-Alrich	A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells			Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent	Fisher Thermo Scientific	PI78243
dNTP mix	Agilent Technologies		Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02	E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine	Fisher Thermo Scientific	BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse	GenScript	A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	EMD Millipore	WBKLS0100
IPTG	Sigma-Alrich	15502-10G
LB	Fisher Thermo Scientific	BP1426-500
Methanol	Fisher Thermo Scientific	A411-20
Pasteurized instant skim milk powder	Local grocery store		No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane	Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences)	10600007	Membrane PT 0.45 µm 200 mm X 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit	Omega	D6943-02	E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX	Boddy Lab		Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers	Intergrated DNA Technologies		Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene	Life Technologies		Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper	Bio-Rad	1703932
Tris base	BioShop	TRS001.1
Tween-20	Sigma-Alrich	P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells			Comeptent cell prepared in house
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
BioSpectrometer	Eppendorf	RK-83600-07
Gel box – PAGE	Bio-Rad	1658005	Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager	Alpha Innotech		AlphaImager EC
Incubator-oven	Fisher Thermo Scientific	11-690-650D	Isotemp
Incubator-shaker	Fisher Thermo Scientific	SHKE6000-7	MaxQ 6000
Personna Razors	Fisher Thermo Scientific	S04615
Power Pack	Bio-Rad	S65533Q	FB300
Transilluminator	VWR International	M-10E,6W
Thermocylcer	Eppendorf	Z316091	Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield		18-999-4542
Waterbath	Fisher Thermo Scientific	15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus	Bio-Rad	1703935	Mini-Trans Blot Cell

Riferimenti

Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
Kim, K. -. J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016)
JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016)
Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).