Подготовка и оценка^99m Tc меченных тридентатной хелатов для предварительной ориентации Использование биоортогональные реакции

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate ^99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing ^99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with ^99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the ^99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

^99m Tc остается доминирующим радиоизотопные используется в диагностической ядерной медицины, с более чем 50 миллионов процедур визуализации , проведенных за год во всем мире ^{1, 2, 3.} Большинство ^99m Tc агентов , используемых клинически являются радиофармпрепаратов типа перфузию. Есть ограниченное количество активно целевых соединений , в которых ^99m Тс направлен связать конкретную биомаркером через лигирования к конструкции прицеливания. Создание целевых ^99m Tc радиофармпрепаратов часто затруднено влиянием ^99m Tc-лигандов комплексов на способность целевой молекулы , чтобы связать биомаркера интерес, или изотопы Период полураспада не достаточно долго для использования с более высокими биомолекул молекулярной массой такие как антитела. Последнее, как правило, требует нескольких дней, прежде чем изображения получены для того, чтобы биомолекулы, чтобы очистить от нецелевых Tiss ЕЭС России. Pre-нацеливание предлагает альтернативный подход для преодоления этих проблем.

Предварительно таргетирования в сочетании с биоортогональные реакции было показано, является эффективным способом для разработки новых зондов молекулярной визуализации как для флуоресценции и радио-томографии ^{4, 5, 6, 7, 8.} Реакция обратного спроса электронный Дильса-Альдера (IEDDA) между 1,2,4,5-тетразин (TZ) и транс -cyclooctene (TCO) производных, как показано на рисунке 1, было показано, что особенно эффективным ^6. Реакцию IEDDA с этими компонентами могут проявлять быструю кинетику в PBS (K ₂ ≈ 6000 M ^-1 с ^-1) и высокой селективностью, что делает его идеальным для предварительного таргетинга приложений в естественных условиях ^{9, 10.}

e_content "> Наиболее распространенным подходом включает введение ТСО полученный нацеливающего вектора и после достаточного периода задержки, радиоизотопный тетразин вводят. радиоактивно меченных тетразины на основе ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr и ¹¹¹ In было сообщила ^{11, 12, 13, 14, 15.} в отличие от этого , есть только один отчет о ^99m Tc-меченого Тг, который был подготовлен с использованием типа лиганда ГНА , требующую использования сопутствующих лигандов для предотвращения связывания белка и деградации в естественных условиях ^16. в качестве альтернативы, мы сообщаем здесь синтез ^99m Tc (I) маркированы тетразины с использованием семейства лигандов , которые образуют стабильные тридентатные комплексы с ^[99m Tc (CO) _3] ⁺ ядро.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pвозраст = "1">
Рисунок 1: bioorthogonal реакция IEDDA между тетразин и транс – -cyclooctene. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Семейство лигандов , приготовленных содержат тридентатные хелаты , которые различаются по полярности и от природы группы линкера между области связывания металла и Tz (рисунок 2). Цель состояла в том, чтобы идентифицировать ^99m Tc-тетразин конструкция , которая может эффективно локализовать и реагировать с TCO-меченых участков в естественных условиях и быстро ясно , когда он не связан, с тем , чтобы принести высокую цель-к-нецелевых коэффициентов. Для тестирования лиганды, ТШО-производное бисфосфоната (ТСО-ВР) использовали ^17. Ранее мы показали, что TCO-BP локализуется в областях активного костного метаболизма и может взаимодействовать срадиоактивномеченые тетразины в естественных условиях ^18. Это удобный реагент для тестирования новых тетразины, так как он может быть получен в одну стадию, и эксперименты могут быть выполнены в нормальных мышей, где локализация происходит в первую очередь в суставах (колени и плечи).

Protocol

Исследования на животных были одобрены советом животных по этике исследований в Университете МакМастер в соответствии с Канадским советом по уходу за животными (ССАС) руководящих принципов. 1. радиоактивной из Tz-тридентатных ЛИГАНДАМИ с 99m Tc ВНИ?…

Representative Results

Лиганды , были синтезированы с использованием различных сшивающих агентов и энтеросорбенты с помощью простого восстановительного аминирования стратегии (рисунок 2), за которой следует соединение продукта с коммерчески доступным тетразин 22,</…

Discussion

Коллекция тетразина-сшитый тридентатных хелатов различной полярностью был подготовлен, и оценивали полезность их ^99m Tc комплексов в реакции IEDDA с производным TCO в естественных условиях. Эффективная и воспроизводимый метод маркировки ^99m Tc была разработана для пяти тетра…

Materials

Argon gas	Alphagaz	—	—
Na2CO3	EMD Millipore	106395	—
Na2B4O7.10H2O	Anachemia	S9640	—
KNaC4H4O6.4H2O	Anachemia	217255	—
Technelite 99mTc generator	Lantheus medical imaging	—	Source of 99mTcO4-
0.9% Saline	Lantheus medical imaging	—	To elute generator
1 M HCl	Lab Chem	—	—
MeOH	Caledon	—	—
ACN	Caledon	—	HPLC grade
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	—
DCM	Caledon	—	—
TFA	Caledon	—	—
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1X
BSA	Sigma Aldrich	A7906	—
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	—
Isoflurane	CDMV	108737	Supplier: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)	—
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm,
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5	Waters	186003115	XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm
Microwave Reactor	Biotage	Initiator 8	—
Biotage V10 Evaporator	Biotage	Serial # V1041	—
Dose calibrator	Capintec, Inc.	CRC-25R	—
Gamma counter	Perkin Elmer	Wizard 1470 Automatic Gamma Counter	—
Animal room scale	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	—
Microwave vials	Biotage	355629	0.5-2 mL