Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane
Summary
Qui, presentiamo pluripotenti umane protocolli di coltura della cellula formativa (hPSC), utilizzata per differenziare hPSCs in CD34+ progenitori ematopoietici. Questo metodo utilizza la modifica di fase-specifici di Canonica WNT segnalazione per specificare le celle esclusivamente al programma ematopoietica sia definitiva o primitivo.
Abstract
Uno degli obiettivi principali per la medicina rigenerativa è la generazione e la manutenzione di cellule staminali ematopoietiche (HSCs) derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Fino a poco tempo, gli sforzi per differenziare hPSCs in HSCs hanno generato principalmente progenitori ematopoietici che mancano di potenziale HSC e invece assomigliano vitellino ematopoiesi. Questi progenitori ematopoietici risultanti potrebbero essere limitato utilità per la modellazione in vitro malattia di vari disordini ematopoietici adulti, in particolare quelli dei lignaggi linfoidi. Tuttavia, recentemente abbiamo descritto i metodi per generare progenitori ematopoietici definitivi multilineare eritro-mielo-linfoidi da hPSCs utilizzando un protocollo di differenziazione diretto fase-specifici, che descriviamo qui. Attraverso la dissociazione enzimatica di hPSCs su plasticware rivestite con matrice della membrana dello scantinato, si formano corpi embryoid (EBs). EBs si differenzino per mesoderma BMP4 ricombinante, che viene successivamente specificato al programma ematopoietico definitivo dall’inibitore GSK3β, CHIR99021. In alternativa, ematopoiesi primitivo viene specificato dall’inibitore PORCN, IWP2. Ematopoiesi è ulteriormente guidato attraverso l’aggiunta del ricombinante VEGF e citochine ematopoietiche solidale. I progenitori ematopoietici risultanti generati utilizzando il metodo hanno il potenziale per essere utilizzato per malattia e modelli inerenti allo sviluppo, in vitro.
Introduction
Cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) sono definite nel senso che comprende sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs) e hanno la capacità unica di non solo in fase di auto-rinnovamento in condizioni di crescita appropriata, ma anche, la capacità di differenziarsi in tutti i tipi di cellule derivate da tre strati di germe: ectoderma, mesoderma ed endoderma1. A causa di queste abilità uniche, hPSCs tenere grande promessa per la medicina rigenerativa, la modellazione di malattia e le terapie basate sulle cellule2. Mentre più tipi di cellule sono stati differenziati con successo dai hPSCs, una sfida significativa è la specifica in vitro di esclusivamente adulto-come hPSC-derivato cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e definitivi progenitori ematopoietici.
Un probabile ostacolo allo sviluppo di HSC umane da hPSCs è la presenza di più programmi ematopoietiche entro l’ embrione umano3. Il primo programma che emerge, definito “primitivo ematopoiesi,” nasce all’interno del tessuto del sacco vitellino extraembryonic e meglio è caratterizzato dalla sua produzione transitoria di progenitori dell’eritroblasto (EryP-CFC), macrofagi e megacariociti. In particolare, questo programma non dà luogo a HSCs, né dà origine ai progenitori linfoidi T e B. Tuttavia, il sacco vitellino transitoriamente dar luogo a progenitori ematopoietici definitivi con restrizioni, come il progenitore eritro-mieloide (EMP4,5,6,7,8) e degli eritrociti-carenti linfoide-innescato multipotenti progenitrici (LMPP9). Tuttavia, EMPs né LMPPs sono completamente multipotenti, o in grado di attecchimento di HSC-come nei destinatari adulti. Al contrario, più avanti in sviluppo, il programma ematopoietico “definitivo” classicamente definito è specificato nella regione dell’aorta-gonade-Mesonefro dell’embrione propriamente detto, dando vita a tutte le filiere emopoietiche adulti, tra cui l’HSC. La specifica di queste cellule ematopoietiche definitive intra-embrionali si verifica in una tacca-dipendente, tramite una transizione endoteliali–emopoietici dal hemogenic dell’endotelio (lui)3,10,11 ,12,13,14. A parte la capacità di ricostituzione, il potenziale di multilineage e tacca-dipendenza di queste cellule può essere utilizzato per distinguere questi progenitori ematopoietici definitivi da EMP e il LMPP (rivisto in riferimenti3,13 ).
Comprendere i meccanismi che disciplinano primitivo e definitiva specifica ematopoietica da hPSCs è probabilmente fondamentale per la produzione riproducibile dei progenitori ematopoietici definitivi attraverso una varietà di linee di hPSC. Fino a poco tempo, protocolli di differenziazione hPSC che potrebbero separare multipotenti progenitori ematopoietici primitivi e definitivi non esisteva15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Molti approcci utilizzando siero bovino fetale (FBS) e/o stromale co-coltura prima delineato il potenziale ematopoietico di differenziazione hPSC, con miscele di primitivo e definitiva ematopoietiche potenziali15,16, 17,19,22,23,25. Ulteriormente, molti protocolli senza siero ematopoietiche sono descritti i requisiti di segnale per la specifica del mesoderma da hPSCs che continuano ad avere potenziale ematopoietico18,20,21, 24. Tuttavia, come questi metodi ancora ha dato luogo a miscele eterogenee di entrambi i programmi, il loro uso in applicazioni cliniche e comprensione dei meccanismi dello sviluppo può essere limitato.
Recentemente abbiamo costruito su questi studi, dopo aver delineato i requisiti del segnale di fase-specifici per ACTIVIN/NODAL e segnalazione di WNT nella specifica ematopoietico primitivo e definitiva dal mesoderma hPSC-derivato18,26 . Quest’ultimo era particolarmente unico, come il suo utilizzo di manipolazione del segnale WNT fase-specifici permette per la specifica di essere esclusivamente primitivo o di progenitori ematopoietici definitivo26esclusivamente. Durante la specifica di mesoderma, l’inibizione di segnalazione WNT canonico con l’inibitore PORCN IWP2 risultati nella specifica di CD43+ EryP-CFC e dei progenitori mieloidi, con nessun potenziale linfoide rilevabile. In netto contrasto, stimolazione della canonica WNT segnalazione con l’inibitore di GSK3β, CHIR99021, durante la stessa fase di differenziazione ha provocato la completa assenza di CD43 rilevabile+ EryP-CFC, mentre contemporaneamente conduceva per la specifica di CD34+CD43− HE. Questa popolazione ha posseduto mieloide, HBG-che esprimono degli eritrociti e potenziale T-linfoide. Successive analisi hanno identificato questo aveva come manca l’espressione di CD7327,28 CD18428e suo potenziale ematopoietico tacca-dipendente28. Più ulteriormente, unicellulare clonale analisi hanno dimostrato che queste filiere emopoietiche definitivi potrebbero essere derivati da cellule multipotenti singola28. Presi insieme, questi studi indicano che fase-specifici WNT segnalazione manipolazione possibile specificare puri primitivi progenitori ematopoietici, oppure multipotenti progenitori ematopoietici definitivi di NOTCH-dipendente.
Qui, descriviamo la nostra strategia di differenziazione che produce esclusivamente primitivi o definitivi progenitori ematopoietici, attraverso la manipolazione delle canoniche WNT segnalazione durante mesodermal patterning e loro a valle lineage ematopoietico saggi. Questo protocollo è di grande valore per i ricercatori che sono interessati nella produzione di progenitori ematopoietici primitivi o definitivi da hPSCs per applicazioni di medicina rigenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo rapido, privo di siero, stroma-free per la differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi. Mesodermal specifica dei progenitori ematopoietici primitivi o definitivi può essere raggiunto in modo affidabile utilizzando il nostro protocollo, che sfrutta in modo univoco piccole molecole inibitrici di segnalazione WNT canonico. L’attivazione di WNT fase-specifici dall’inibitore GSK3β CHIR9902133 dà luogo a definitiva mesoderma ematopoietico…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta dal dipartimento di medicina interna, divisione di ematologia, Washington University School of Medicine. CD è stato supportato da T32HL007088 dal cuore nazionale, polmone e sangue Institute. CMS è stato supportato da una società americana di ematologia Scholar Award.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
Riferimenti
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