हम वर्तमान अध्ययन में मौजूद एक उपन्यास प्रतिदीप्ति आधारित एक ट्रांसजेनिक माउस से निकाली गई लिम्फोसाइट का उपयोग परख। इस परख सकते हैं या तो बाधा या लिम्फोसाइट सक्रियण को बढ़ावा देने की क्षमता के साथ संपन्न छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए उपयुक्त है।
उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) वर्तमान में रासायनिक जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं या सेलुलर प्रक्रियाओं नियमन करने में सक्षम संस्थाओं की पहचान के लिए मुख्य आधार है। जैव प्रौद्योगिकी की उन्नति और छोटे अणुओं के उच्च translational क्षमता के साथ, दवाओं की खोज में नवीन दृष्टिकोण की एक संख्या विकसित किया है, जो एचटीएस के उपयोग में उभरते ब्याज बताते हैं। ऑन्कोलॉजी क्षेत्र वर्तमान में दवा स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक सक्रिय अनुसंधान के क्षेत्र, प्रत्यारोपण से संबंधित जटिलताओं या स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों को लक्षित नई इम्यूनोमॉड्यूलेटरी यौगिकों की पहचान के लिए किया जाता है कोई बड़ी सफलता के साथ है। यहाँ, हम इन विट्रो murine फ्लोरोसेंट आधारित लिम्फोसाइट परख में एक उपन्यास आसानी से नए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी यौगिकों की पहचान के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं। इस परख टी या बी कोशिकाओं एक ट्रांसजेनिक माउस, जिसमें Nur77 प्रमोटर टी या बी सेल रिसेप्टर उत्तेजना पर ड्राइव GFP अभिव्यक्ति से निकाली गई उपयोग करता है। GFP तीव्रता को दर्शाता है के रूप मेंलक्ष्य सेल के सक्रियण / ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि, हमारे परख सेलुलर / जैविक प्रतिक्रियाओं पर दिए गए परिसर (एस) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण को परिभाषित करता है। उदाहरण के लिए, एक प्राथमिक स्क्रीनिंग एक 'लक्ष्य परिकल्पना ", जो 160 संभावित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधियों को प्रदर्शित हिट की पहचान करने के लिए नेतृत्व के अभाव में 4398 यौगिकों का उपयोग किया गया था। इस प्रकार, इस परख के उपयोग में इन विट्रो / विवो सत्यापन पढ़ाई को आगे करने से पहले बड़ी रासायनिक पुस्तकालयों की खोज दवाओं की खोज के कार्यक्रमों के लिए उपयुक्त है।
उच्च throughput प्रदर्शन (एचटीएस) एक सिद्ध रणनीति में व्यापक रूप से नए चिकित्सीय अणु की पहचान के लिए या नए संकेत चिकित्सा में एफडीए को मंजूरी दी दवाओं के repositioning के लिए अपनाया है। 1 अब तक हासिल एचटीएस सफलता में पहले की खोज की दवाओं की अधिकता से मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, tyrosine kinase अवरोध lapatinib स्तन कैंसर, sitagliptin के इलाज के लिए इस्तेमाल किया; एक dipeptidyl पेप्टिडेज़ -4 (डीपीपी -4) अवरोध करनेवाला एक विरोधी hyperglycemic दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है, और मौखिक BCR-Abl tyrosine kinase अवरोध पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया के इलाज के लिए इस्तेमाल किया dasatinib दवाओं को मंजूरी दी मूलतः द्वारा की खोज की एक लंबी सूची के कुछ उदाहरण का प्रतिनिधित्व एचटीएस। 2 हालांकि दवा उद्योग की उत्पादकता में हाल ही में नए रासायनिक संस्थाओं की खोज में कमी से पीड़ित है, सफल दवाओं की खोज की संभावना पूर्व नैदानिक कैंडिडा की संख्या में वृद्धि के माध्यम से सुधार किया जा सकताटीईएस modulatory जैविक / जैव रासायनिक गुण प्रदर्शित। तदनुसार, प्ररूपी स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित नई एचटीएस assays के विकास की क्षमता नई दवा हिट की खोज के लिए महत्वपूर्ण औषधीय उपकरण प्रदान करने की पेशकश कर सकता। 3, 4, 5, 6 इसके अलावा, एचटीएस अब कस्टम डिजाइन लचीला रोबोट प्रतिष्ठानों, उपन्यास पढ़ने के लिए बाहर प्रौद्योगिकियों और व्यापक miniaturization सहित हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण तकनीकी परिवर्तनों के कारण एक तेज गति से किया जा सकता है। 2, 7 कारकों प्ररूपी स्क्रीनिंग (उर्फ आगे औषध विज्ञान) के उपयोग में बढ़ती रुचि के लिए योगदान के अलावा धारणा है कि आणविक लक्ष्य (लक्ष्य आधारित स्क्रीनिंग / जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं) के बारे में oversimplified न्यूनीकारक मान्यताओं के बजाय कार्यात्मक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित कर अधिक होने की संभावना है दर्शाना डब्ल्यू नैदानिक प्रभावकारिता। इस प्रकार, प्ररूपी स्क्रीनिंग नए संभावित चिकित्सीय यौगिकों और वर्तमान में असाध्य रोगों की आणविक रास्ते उजागर करने के लिए वादा है। 2
ठीक से एक दिया आणविक लक्ष्य या सेलुलर समारोह के लिए अवरोधकों या activators की पहचान करने के लिए, एक बेहद संवेदनशील और विश्वसनीय परख आदेश सदाशयी हिट और झूठी सकारात्मक के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। तो, क्या एक अच्छा परख बनाता है? एक दिया परख की गुणवत्ता पहले संकेत करने वाली शोर अनुपात (एक जेड कारक के माध्यम से परिलक्षित) द्वारा न्याय किया जाना चाहिए। 8 दूसरा, लक्षित प्रभाव या स्क्रीन के लक्ष्य को स्पष्ट रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक सेल आधारित दृष्टिकोण के रूप में एक परख विशेष रूप से बाध्यकारी ligand रिसेप्टर का आकलन करने के लिए तैयार करने के लिए विरोध रिसेप्टर स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकते हैं। इस का कारण यह है कि बाद के दृष्टिकोण एगोनिस्ट और प्रतिपक्षी ligands के बीच अंतर नहीं कर सकता है।एस एस = "xref"> 9 इसके विपरीत, एक सेल आधारित दृष्टिकोण (भेदभाव प्रसार, सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis, और / या) को और अधिक प्रभावी रूप रिसेप्टर समारोह सीधे एक जैविक phenotype में मूल्यांकन किया जा सकता होने की संभावना है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जैव रासायनिक assays प्ररूपी assays से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकते हैं के रूप में वे एक विशिष्ट intracellular लक्ष्य पर उल्लंघन। एक अच्छी तरह से अनुकूलित जैव रासायनिक परख आम तौर पर एक प्ररूपी स्क्रीनिंग की तुलना में कम डेटा बिखराव होगा, जबकि बाद में कार्रवाई की दवा आणविक तंत्र से संबंधित जांच को सरल बनाने। हालांकि, लक्ष्य के आधार पर या जैव रासायनिक assays की बड़ी खामी झूठी सकारात्मक हिट जब एक जैविक प्रणाली (विशिष्टता मूल रूप से जैव रासायनिक परख में अध्ययन के नुकसान) में परीक्षण गैर विशिष्ट लक्ष्यों को प्रभावित कर सकता है कि की दर amplifying की संभावना है। 10 हालांकि नकारात्मक और सकारात्मक हिट के बीच एक अच्छी तरह से स्थापित कट ऑफ बिंदु झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर सकते हैं मैंn प्राथमिक स्क्रीनिंग, एक physiologically प्रासंगिक ऐसे बरकरार कोशिकाओं, पूरे ऊतक या पूरे जानवर के रूप में देशी सेलुलर पर्यावरण नकल उतार प्रणाली के उपयोग परख डिजाइन पेंडुलम की कोर बनी हुई है। इसलिए, प्ररूपी स्क्रीनिंग यौगिक की गतिविधि या कार्रवाई की विधा के पूर्व ज्ञान के बिना कोई पहचान दवा लक्ष्य के साथ रोगों के लिए वांछनीय जैविक / प्ररूपी प्रभाव के साथ नेतृत्व की खोज के लिए सक्षम बनाता है। 1 1
एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस मॉडल और रासायनिक यौगिकों के एक संकुल उप-family: इस के साथ साथ अध्ययन के विकास और एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने प्ररूपी दो महत्वपूर्ण घटकों पर आधारित स्क्रीनिंग के परीक्षण का सवाल है। पशु मॉडल के लिए सम्मान के साथ, परख, जिसमें हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति वें से प्रेरित है एक माउस तनाव (Nur77 GFP) के एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र एक कैसेट युक्त शरण देने से निकाली गई लिम्फोसाइटों के उपयोग पर निर्भर करता हैई Nur77 प्रमोटर। 12 इस उत्तेजना की बानगी तथ्य यह है कि Nur77 एक तत्काल जल्दी जीन टी सेल रिसेप्टर (TCR) या बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) उत्तेजना के बाद विनियमित है पर आधारित है। 12 स्क्रीनिंग विधि खुद के लिए के रूप में, एक दृष्टिकोण तुच्छ analogues की स्क्रीनिंग से परहेज करते हुए समय एक बड़ी रासायनिक पुस्तकालय (> 10 5 यौगिकों) का आकलन करने की जरूरत को कम करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ऐसा करने के लिए, आभासी स्क्रीनिंग उपकरण का उपयोग औषधीय दवा की दुकानों द्वारा चयनित रासायनिक यौगिकों का एक डाटाबेस संदर्भ के रूप में जाना जाता सक्रिय बीज संरचनाओं का उपयोग topologically इसी तरह के यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण हमें 136.000 से अधिक रासायनिक संस्थाओं की एक समग्र पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व 4398 यौगिकों स्क्रीन करने के लिए अनुमति दी।
कई पढ़ने के लिए बाहर तरीकों संवेदनशील और विश्वसनीय एचटीएस assays के विकास के लिए शोषण किया गया है। ये वर्णमिति, luminescent या फ्लोरोसेंट तरीके शामिल हैं। हालांकि वर्णमिति तरीकों सेट अप करने के लिए सरल कर रहे हैं,…
The authors have nothing to disclose.
इस काम Université de मॉन्ट्रियल द्वारा प्रदान की मर्क Frosst शुरू हुआ धन द्वारा समर्थित किया गया। हम उनकी चर्चा, टिप्पणियों और फीडबैक के लिए इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान संस्थान में उच्च throughput मंच से डीआरएस जीन Duchaine और डोमिनिक Salois को धन्यवाद देना चाहूंगा। Moutih Rafei एक Fonds डी ला Recherche एन Santé डु क्यूबेक जूनियर 1 पुरस्कार रखती है।
Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |