Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole
Summary
Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.
Abstract
lo screening high-throughput (HTS) è attualmente il pilastro per l'identificazione delle entità chimiche in grado di modulare le reazioni biochimiche o processi cellulari. Con l'avanzamento delle biotecnologie e l'alto potenziale traslazionale di piccole molecole, un certo numero di approcci innovativi nella scoperta di nuovi farmaci si sono evoluti, il che spiega il rinnovato interesse per l'uso di HTS. Il campo oncologico è attualmente l'area di ricerca più attive per lo screening di stupefacenti, senza alcun importante passo avanti fatto per l'identificazione di nuovi composti immunomodulanti di targeting complicazioni trapianto legati o disturbi autoimmuni. Qui, vi presentiamo un romanzo di test di linfociti fluorescente a base murino vitro facilmente adattato per l'identificazione di nuovi composti immunomodulatori. Questo saggio utilizza cellule T o B derivati da un topo transgenico, in cui il promotore Nur77 spinge espressione GFP upon T- o stimolazione del recettore B-cellule. Poiché l'intensità GFP riflette laAttivazione / attività trascrizionale della cellula bersaglio, il nostro saggio definisce un nuovo strumento per studiare l'effetto di dato composto (s) in risposte cellulari / biologiche. Per esempio, uno screening primario è stato eseguito utilizzando 4.398 composti in assenza di un "ipotesi target", che ha portato all'identificazione di 160 potenziali risultati che mostrano attività immunomodulante. Pertanto, l'uso di questo dosaggio è adatto per i programmi di scoperta di nuovi farmaci che esplorano grandi librerie chimiche prima di proseguire in vitro che in vivo studi / validazione.
Introduction
screening ad alto rendimento (HTS) è una strategia collaudata ampiamente adottata per l'identificazione di nuove molecole terapeutiche o per il riposizionamento dei farmaci approvati dalla FDA a nuove indicazioni mediche. 1 Finora, il successo ottenuto HTS può essere misurata dalla pletora di farmaci precedentemente scoperto. Per esempio, l'inibitore lapatinib tirosina chinasi utilizzato per il trattamento del cancro al seno, sitagliptin; un inibitore della dipeptidil peptidasi-4 (DPP-4) inibitore utilizzato come un farmaco anti-iperglicemici, e la Bcr-Abl dasatinib inibitore della tirosin-chinasi orale, usati per il trattamento della leucemia mieloide cronica rappresentano alcuni esempi di una lunga lista di farmaci approvati originariamente scoperti da HTS. 2 Sebbene la produttività dell'industria farmaceutica ha recentemente sofferto di una mancanza nella scoperta di nuove entità chimiche, la probabilità di scoperta di farmaci successo può essere migliorata attraverso un aumento del numero di candida pre-clinicates visualizzazione modulatori proprietà biologiche / biochimiche. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi test HTS adatti per lo screening fenotipico potrebbe offrire il potenziale per fornire importanti strumenti farmacologici per la scoperta di nuovi successi di droga. 3, 4, 5, 6, inoltre, HTS possono ora essere eseguiti a un ritmo più veloce a causa di significative trasformazioni tecnologiche degli ultimi anni inclusi gli impianti progettati su misura flessibili robot, tecnologie di read-out nuovi e ampie miniaturizzazione. 2, 7 Tra i fattori che contribuiscono al crescente interesse per l'uso dello screening fenotipico (aka avanti farmacologia) è la percezione che concentrarsi sugli effetti funzionali, piuttosto che ipotesi riduzioniste semplificate in materia di bersagli molecolari (di screening / reazioni biochimiche di obiettivi) è più probabile per sho w efficacia clinica. Così, lo screening fenotipico mantiene la promessa per scoprire nuovi composti potenzialmente terapeutici e meccanismi molecolari di malattie attualmente incurabili. 2
Per identificare correttamente inibitori o attivatori di un determinato bersaglio molecolare o la funzione cellulare, un saggio altamente sensibile e affidabile è necessario al fine di differenziare tra i colpi in buona fede e falsi positivi. Quindi, ciò che rende un buon test? La qualità di un determinato dosaggio deve essere dapprima giudicato dal rapporto segnale-rumore (riflessa attraverso un fattore Z). 8 In secondo luogo, l'effetto mirato o l'obiettivo dello schermo devono essere chiaramente stabiliti. Ad esempio, gli approcci basati su cellule funzionali in grado di offrire vantaggi significativi per lo screening dei recettori in contrapposizione a un test specificamente progettato per valutare ligando-recettore vincolante. La ragione di questo è che quest'ultimo approccio non può distinguere tra agonisti e antagonisti ligandi.ss = "xref"> 9 Al contrario, un approccio a base di cellule è probabilmente più efficace in funzione del recettore può essere valutata direttamente in un fenotipo biologica (proliferazione, arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e / o differenziazione). Tuttavia, si deve notare che saggi biochimici possono fornire vantaggi significativi rispetto saggi fenotipici poiché violano su uno specifico bersaglio intracellulare. Un test biochimico ben ottimizzato in genere hanno meno dispersione dei dati di uno screening fenotipico, semplificando dopo indagini connesse con il meccanismo molecolare della droga di azione. Tuttavia, il grave inconveniente di saggi di obiettivi o biochimica è la possibilità di amplificare il tasso di risultati falsi positivi che possono influenzare obiettivi non specifici quando testato in un sistema biologico (perdita della specificità originariamente studiato nel saggio biochimico). 10 Anche se un punto di cut-off ormai consolidata tra i colpi negativi e positivi può ridurre al minimo il numero di falsi positivi in screening preliminare, l'uso di un sistema fisiologicamente rilevanti mimando l'ambiente cellulare nativo come le cellule intatte, tessuti interi o intero animale rimane il nucleo del pendolo disegno dosaggio. Pertanto, lo screening fenotipico consente scoperta vantaggio con effetti fenotipici biologici / desiderabili per le malattie senza bersagli farmacologici identificati senza avere una conoscenza preventiva di attività o modalità di azione del composto. 11
Lo studio qui riguarda lo sviluppo e la sperimentazione di uno screening fenotipico ottimizzato e riproducibili sulla base di due componenti importanti: un modello di topo disponibile in commercio e un cluster sotto-famiglia di composti chimici. Rispetto al modello animale, il saggio si basa sull'impiego di linfociti derivati da un ceppo di topi (Nur77 GFP) ospitare un cromosoma artificiale batterico contenente una cassetta in cui l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) è azionato da the Nur77 promotore. 12 La caratteristica di questa stimolazione è basata sul fatto che Nur77 è immediatamente gene precoce up-regolata seguente recettore delle cellule T (TCR) o stimolazione del recettore delle cellule B (BCR). 12 Per quanto riguarda il metodo di screening per sé, un approccio è stato utilizzato per contribuire ad evitare la proiezione di analoghi banali riducendo al minimo il tempo necessario per valutare una grande libreria chimica (> 10 5 composti). Per fare ciò, una banca dati di composti chimici selezionati dai chimici medicinali che utilizzano strumenti di screening virtuali è stata sfruttata per identificare i composti topologicamente simili utilizzando note strutture di semi attivi come riferimenti. Questo approccio ci ha permesso di selezioniamo 4.398 composti che rappresentano una libreria complessiva di oltre 136.000 entità chimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi metodi read-out sono stati sfruttati per lo sviluppo di saggi HTS sensibili ed affidabili. Questi includono colorimetrica, luminescenti o metodi fluorescenti. Anche se i metodi colorimetrici sono semplici da set-up, che richiedono più aggiunte di sostanze chimiche, che possono interferire o disturbare le cellule in fase di sperimentazione. 23 Inoltre, essi non consentono valutazione dinamica di una risposta biologica come effetto farmacologico è valutata a un endpoint specifico. Inoltre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Merck Frosst fase di avviamento concessi da Université de Montréal. Vorremmo ringraziare i dottori Jean Duchaine e Dominic Salois dalla piattaforma high-throughput presso l'Istituto di Ricerca in Immunologia e il cancro per la loro discussione, commenti e feedback. Moutih Rafei detiene una Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 premio.
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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