I hjärtat, molekylära händelser samordna elektriska och kontraktila funktion av organet. En uppsättning av lokala fält fluorescensmikroskopi tekniker som presenteras här möjliggör inspelningen av cellulära variabler i intakta hjärtan. Identifiera mekanismer som definierar hjärtfunktion är viktiga för att förstå hur hjärtat fungerar under patologiska situationer.
I hjärtat är molekylära signal studier vanligtvis i isolerade myocyter. Men många patologiska situationer såsom ischemi och arytmier kan endast till fullo förstås vid hela organnivå. Här presenterar vi den spektroskopiska teknik för lokal fält fluorescensmikroskopi (LFFM) som möjliggör mätning av cellulära signaler i den intakta hjärtat. Tekniken är baserad på en kombination av en Langendorff perfusion hjärta och optiska fibrer för att spela in fluorescerande signaler. LFFM har olika tillämpningar inom kardiovaskulär fysiologi att studera hjärtat under normala och patologiska tillstånd. Flera hjärt variabler kan övervakas med hjälp av olika fluorescerande indikatorer. Dessa inkluderar cytosolisk [Ca2 +], intra-sarko nätmagen [Ca2 +] och membranpotentialer. De exogena fluorescerande prober är glada och den emitterade fluorescensen detekterades med tre olika arrangemang av LFFM epifluorescence tekniks presenteras i detta dokument. De centrala skillnader bland dessa tekniker är den typ av ljuskälla som används för excitering och på vägen excitationsljuset moduleras. Den pulsade LFFM (PLFFM) använder laserljuspulser medan kontinuerlig våg LFFM (CLFFM) använder kontinuerligt laserljus för excitering. Slutligen tillsattes Ijusemitterande dioder (LED) används som en tredje ljuskälla. Denna icke-koherent arrangemang kallas pulse LED fluorescensmikroskopi (PLEDFM).
Hjärtat är den centrala organ i det kardiovaskulära systemet. Hjärtats kontraktion initieras av en ökning av intracellulär [Ca2 +]. Förhållandet mellan elektriska retbarhet och förändringar i intracellulär Ca2 + frisättning har historiskt studerats i enzymatiskt dissocierade celler 1, 2. Emellertid hjärtceller är elektriskt, metaboliskt och mekaniskt kopplade 3, 4. När isolerade, de myocyter är inte bara fysiskt ansluten, men myocyter från olika skikt blandas under dissociation 5. Dessutom, trots de enorma fördelar som framkommit i studien av isolerade celler under spänningsklämförhållanden, 6, 7, 8 inneboende karaktären av hjärtat som en elektrisk syncytium always ställer frågan om hur funktionellt olika dissocieras celler från de som finns i vävnaden tre.
I detta manuskript, beskriver vi de framsteg som erhållits i kunskapen om hjärtats fysiologi med hjälp av lokala fält fluorescensmikroskopi (LFFM) tekniker i den intakta hjärtat. LFFM använder fluorescerande indikatorer för att mäta flera fysiologiska variabler såsom cytosoliskt Ca2 +, intra sarko nätmagen (SR) Ca 2+ och membranpotential. Dessa mätningar kan erhållas samtidigt och i samband med kammartryck 9, 10, elektrokardiogram 9, elektriska aktionspotentialer (APS), joniska ström inspelningar och flash fotolys av bur föreningarna 4, 11. Dessutom kan dessa mätningar erhållas genom pacing den intakta hjärtat vid högre frekvenser närar till fysiologiska priser. Även flera artiklar 9, 11, 12, 13, 14 har publicerats av vår grupp använder LFFM tekniker har antagandet av tekniska komplikationer i samband med denna teknik förhindras sin massiva användning studera ex vivo fysiologiska fenomen i hjärtat och andra organ.
Den LFFM tekniken (figur 1) är baserat på epifluorescence mätningar erhållna med användning av en optisk multimodfiber i kontakt med vävnaden. Precis som alla kontakt fluorescens bildteknik, den optiska upplösningen beror på diametern och den numeriska aperturen (NA) hos fibern. En högre NA och mindre diameter hos fibern kommer att öka den rumsliga upplösningen av mätningarna. NAS och fiberdiametrar kan sträcka sig från 0,22 till 0,66 och från 50 | im till 1 mm, respektive. Iskrynklas NA kommer att förbättra signalbrusförhållandet (S / N) genom att acceptera fotoner som anländer från en större rymdvinkel. För att fungera som en epifluorescence enhet, är ljusstrålen fokuseras i den optiska fibern med en asfärisk lins eller en epifluorescence mål där NA av linsen och fibern matchen. Denna matchning maximerar energiöverföringen för excitation och för att samla tillbaka fotoner som avges av fluoroforen.
För att excitera de exogena fluorescerande indikatorer laddade i vävnaden, kan olika ljuskällor och belysningslägen användas. Våra banbrytande studier med den pulsade lokala fältet fluorescensmikroskopi 3, 12 (PLFFM) använde en låg kostnad pikosekund laser (Figur 1a, PLFFM). Denna typ av ljuskälla har stor fördel av spännande en stor del av fluoroforen molekyler under belysningsområdet utan att väsentligen blekning av färgämnet på grundtill den korta pulsvaraktigheter 12. Dessutom, användningen av ultrakorta pulser tillät bedömning av fluorescenslivstid av färgämnet 12. Den fluorescenslivstid är en egenskap som kan användas för att kvantifiera den fraktion av färgämnesmolekyler bundna till Ca 2 +. Tyvärr, den tidsmässiga bilden darrar av pulserna och variationer i amplitud från puls-till-puls begränsa tillämpningen av denna experimentella strategi till fall där förändring i fluorescens som produceras av ligandbindning till färgämnet är stort.
Kontinuerlig våg (CW) lasrar används vanligen som huvudbelysningskällan i LFFM (figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerligt belysa vävnaden eller kan ferroelectrically moduleras. Det ferroelektriska modulering av strålen tillåter alstring av mikrosekunders pulser av ljus. Denna modulering kan kontrolleras genom extern hårdvara. Detta förfarande minskar inte bara dramatiskt than temporal flimret av ljuspulser utan gör det också möjligt att blanda strålar av olika våglängder. Blandningen av balkarna sker genom multiplexering av strålar från olika lasrar. Som en följd av detta kan flera färgämnen med olika spektrala egenskaper vara glada att utföra mätningar av olika fysiologiska variabler, till exempel, Rhod-2 för cytosoliskt Ca2 +, MagFluo4 för intra-SR Ca 2 + och di-8-ANEPPS för membranpotential.
Fastän lasrar är närvarande olika fördelar som ljuskälla i LFFM, kan andra typer av ljuskällor användas innefattande Ijusemitterande dioder (LED). I detta fall bestod excitationsljuset källa för en InGaN lysdiod (fig 1c, PLEDFM). I lysdioder, är fotoner spontant emitteras när elektroner från ledningsbandet rekombinerar med hål i valensbandet. Skillnaden med solid-state laser är att utsläppen inte stimuleras av andra fotoner. Detta resulterar i en icke-koherent stråle ochen bredare spektralemission för lysdioder.
Olika typer av hög effekt lysdioder kan användas. För AP inspelningar med Di-8-ANEPPS och Ca 2 + transienter som spelats in med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, använde vi en lysdiod som har en typisk toppemission vid 485 nm (blå) och en halv bredd av 20 nm (figur 1d). För Ca2 + transienter som spelats in med Rhod-2, hade lysdioden en typisk toppemission vid 540 nm (grön) och en halv bredd av 35 nm (figur 1d). Lysdioder avger i ett band våglängd och därför kräver filter för att begränsa deras spektrala utsläpp. Dessutom kan pulserat ljus alstras med en hastighet av 1,6 kHz med varaktigheten av 20 ^ s. Lysdioderna pulserades med en snabb effekt-MOSFET fälteffekttransistor. Samtidiga inspelningar med olika indikatorer kan utföras genom tidsmultiplexering lysdioderna. Tyvärr, är ljus som sänds ut av lysdioder mer svårt att fokusera på en fiberoptisk jämfört med en laserstråle. Således, den stora nackdelen av ossing lysdioder är att deras utsläppsprofiler har vinkelförskjutningar (± 15 °) från huvudaxeln, och en extra optisk måste användas för att rätta till det.
I alla de optiska konfigurationer som tidigare beskrivits, är exciteringsljuset reflekteras med hjälp av en dikroisk spegel. Strålen därefter fokuseras av en asfärisk lins och ett mikroskopobjektiv på en multimode fiberoptisk som är placerad på vävnaden. Som i alla epifluorescence arrangemang, den dikroiska spegeln tjänar också till att separera excitering från det utsända ljuset. Det emitterade ljuset spektrum färdas tillbaka genom ett spärrfilter för att avlägsna eventuellt reflekterade excitering. Slutligen är det emitterade ljuset fokuseras med ett mål på en fotodetektor (Figur 1).
Transduktionen från ljus till elektrisk ström utförs genom kisellavinfotodioder. Dessa dioder har en snabb respons och hög känslighet gör det möjligt svagt ljus upptäckt. Defotoström som alstras av lavinfotodioder kan amplifieras på två sätt: en transimpedansförstärkare som har ett resistivt återkopplingselement (Figur 1e) eller av en integrator för att omvandla strömmen till en spänning (figur 1f). Med användning av den första metoden, är utspänningen som är proportionell mot fotoströmmen och återkopplingsmotståndet. Ett typiskt exempel på den resistiva detektering av pikosekund laserpulser visas i figurerna 2a, 2b och 2c. Panel 2a illustrerar utsignalen från transimpedansförstärkaren och panel 2b visar en tidsexpansion av intervallet indikeras med en asterisk (*). En topp spårning algoritm genomfördes för att detektera toppen (röd) och basen (grön) för fluorescerande svar 12. Mätningen av basen fluorescens ger information av både den mörka strömmen hos lavinfotodiod och störningarna som införs genom omgivnings light och elektromagnetisk koppling. En representation av toppar och baser visas i figur 2c. Denna figur illustrerar den fluorescens som emitteras av färgämnet (Rhod-2) bundet till Ca 2 + under hjärtcykeln av stryk undulat hjärta.
I den andra metoden, är utspänningen från integratorn en funktion av strömmen och kapacitiv återkoppling (figurerna 2d, 2e och 2f). Figur 2F visar två på varandra följande cykler integration: den första utan ytterbelysning och andra med pålagda ljuspulser från en pulsad LED. En detaljerad beskrivning presenteras i figurerna 2g och 2h. Detta tillvägagångssätt, även om mer arbetskrävande, ger en större S / N på grund av frånvaron av termiskt brus i återkopplingskondensator. Instrumentet innehåller en tidssteg som genererar all kontroll och multiplexering av excitationsljuset och beordrar huvudsteg integration och reset perioder. Detta utförs vanligtvis med en digital signalbehandlingskrets som även utför en digital differentiering av den integrerade utsignalen genom att beräkna en on-line regression av data. I fallet med användning av en resistiv återkoppling, kan vilken som helst A / D-upptagningskortet.
Slutligen är vår LFFM teknik mycket mångsidig och kan anpassas för att spela in från mer än en region. Tillsats av en stråldelare i strålgången tillåter oss att dela upp ljuset i två optiska fibrer. Varje optisk fiber kan sedan placeras på olika regioner i en servett för att oberoende excitera och emissions rekord från exogena fluorescerande prober. Denna ändring gör det möjligt för oss att bedöma hur anatomiska regionala skillnader påverkar fysiologiska variabler. Figur 3 visar en stråldelare som utnyttjas för att dela upp CW excitationsljus så att två optiska fibrer används för att mäta transmural elektrisk eller intracellulär [Ca2 +] nivåer with moll-invasivt. Transmural signaler kan spelas in genom att placera en fiber på endokardium och den andra på epikardium lagret av kammarväggen. Därför har de LFFM teknik möjligheten att mäta tidsförloppet av cellulära signaler i olika regioner och kan användas för att testa om regionala förändringar inträffa under patologiska situationer.
Detta papper är centrerad vid beskrivning lokala fält fluorescenstekniker för att utvärdera funktionen av hjärtmyocyter ex vivo. Studiet av dessa celler i en kopplad miljö är inte bara mer fysiologisk, men är också mycket lämpligt för att bedöma organnivå patologier. De cellulära händelser som ligger till grund excitation-kontraktion koppling (ECC) kan utvärderas på hela organnivå med hjälp av molekylära prober som övervakar intracellulära Ca2 + dynamik (Rhod 2 cytosoliskt Ca2 <…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Alicia Mattiazzi för kritisk diskussion av det presenterade arbetet. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (R01 HL-084.487) till ALE.
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
LabView | National Instruments | ||
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |