Lokale Field fluorescentiemicroscopie: Beeldvorming van cellulaire signalen in Intact Hearts
Summary
In het hart, moleculaire gebeurtenissen coördineren van de elektrische en contractiele functie van het orgel. Een set van de lokale veld fluorescentiemicroscopie technieken hier gepresenteerde maakt de registratie van cellulaire variabelen in intacte harten. Het identificeren van mechanismen voor het definiëren van de hartfunctie is van cruciaal belang in het begrijpen hoe het hart werkt onder pathologische situaties.
Abstract
In het hart, zijn moleculaire signalering studies meestal uitgevoerd in geïsoleerde myocyten. Veel pathologische situaties, zoals ischemie en hartritmestoornissen kunnen alleen volledig worden begrepen op het gehele orgaan niveau. Hier presenteren we de spectroscopische techniek van het lokale veld fluorescentie microscopie (LFFM) dat de meting van cellulaire signalen in het intacte hart toelaat. De techniek is gebaseerd op een combinatie van een Langendorff geperfundeerde hart en optische vezels fluorescentiesignalen nemen. LFFM heeft verschillende toepassingen op het gebied van cardiovasculaire fysiologie het hart te bestuderen onder normale en pathologische omstandigheden. Meerdere cardiale variabelen kunnen worden gevolgd met verschillende fluorescente indicatoren. Deze omvatten cytosolisch [Ca 2+], intra-sarcoplasmatisch reticulum [Ca 2+] en membraan potentials. De exogene fluorescerende probes zijn enthousiast en de uitgezonden fluorescentie gedetecteerd met drie verschillende arrangementen van LFFM epifluorescentie technieks in dit document. Het centrale verschil tussen deze technieken zijn de soort lichtbron voor excitatie en onderweg het excitatielicht wordt gemoduleerd. De gepulseerde LFFM (PLFFM) maakt gebruik van laser lichtpulsen, terwijl continue golf LFFM (CLFFM) maakt gebruik van continue laserlicht voor excitatie. Tenslotte, light-emitting diodes (LED's) gebruikt als een derde lichtbron. Deze niet-coherente opstelling wordt genoemd gepulseerd LED fluorescentie microscopie (PLEDFM).
Introduction
Het hart is het centrale orgaan van het cardiovasculaire systeem. Samentrekking van het hart wordt geïnitieerd door een toename van intracellulaire [Ca2 +]. De relatie tussen de elektrische prikkelbaarheid en veranderingen in de intracellulaire Ca 2+ release van oudsher bestudeerd in enzymatisch gedissocieerde cellen 1, 2. Echter, hartcellen elektrisch, metabolisch en mechanisch gekoppeld 3, 4. Wanneer die de myocyten zijn niet alleen fysiek ontkoppeld, maar myocyten uit verschillende lagen worden gemengd tijdens de dissociatie 5. Verder ondanks de enorme voordelen die uit de studie van geïsoleerde cellen ontstaan onder voltage clamp omstandigheden, 6, 7, 8 de intrinsieke aard van het hart als een syncytium elektrische always stelt de vraag hoe functioneel verschillende worden gescheiden cellen van de aanwezigen in het weefsel 3.
In dit manuscript beschrijven we de vooruitgang in de kennis van hartfysiologie verkregen door middel van lokale veld fluorescentiemicroscopie (LFFM) technieken in het intacte hart. LFFM gebruikt fluorescente indicatoren voor verschillende fysiologische variabelen zoals cytosolische Ca2 +, intra sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca2 + en membraanpotentiaal meten. Deze metingen kunnen gelijktijdig en in combinatie verkrijgbaar ventrikeldruk 9, 10, 9 elektrocardiogrammen, elektrische actiepotentialen (AP's), ionenstroom opnames en flitsfotolyse gekooide verbindingen 4, 11. Bovendien kunnen deze metingen worden verkregen door pacing het intacte hart op hogere frequenties closer om fysiologische tarieven. Hoewel verschillende artikelen 9, 11, 12, 13, 14 zijn door de groep met behulp van LFFM technieken gepubliceerd, heeft het vermoeden van de technische complexiteit in verband met deze techniek het massale gebruik voorkomen in het bestuderen van ex vivo fysiologische verschijnselen in het hart en andere organen.
LFFM de techniek (figuur 1) is gebaseerd op epifluorescentie metingen verkregen met een multimode optische vezel in contact met het weefsel. Als contact fluorescentie beeldvormende techniek, de optische resolutie hangt af van de diameter en de numerieke apertuur (NA) van de vezel. Een hogere NA en kleinere diameter van de vezel wordt de ruimtelijke resolutie van de meting verhogen. NA en vezeldiameter kan variëren 0,22-0,66 en van 50 urn tot 1 mm, respectievelijk. Invouwen het NA zal de signaal-ruisverhouding (S / N) te verbeteren door aanvaarding fotonen aankomen uit een grotere ruimtehoek. Om te werken als een epifluorescentie inrichting wordt het licht gefocusseerd op de optische vezel met een asferische lens of een epifluorescentie doelstelling waarbij de NA van de lens en de vezel spel. Deze matching maximaliseert de energie-overdracht voor excitatie en voor het verzamelen van de rug van de fotonen uitgezonden door het fluorofoor.
Om de exogene fluorescente indicatoren in het weefsel prikkelen geladen kunnen verschillende lichtbronnen en verlichtingsmodi worden gebruikt. Onze baanbrekende studies met behulp van de gepulste lokale veld fluorescentiemicroscopie 3, 12 (PLFFM) gebruik van een low-cost picoseconde laser (figuur 1a, PLFFM). Dit type lichtbron biedt het enorme voordeel van het opwekken van een grote fractie van fluorofoor moleculen onder de verlichtingsgebied zonder significante bleken van de kleurstof te wijtende korte pulsduren 12. Bovendien kan het gebruik van ultrakorte pulsen mag de beoordeling van de fluorescentie levensduur van de kleurstof 12. De fluorescentie levenstijd is een eigenschap die kan worden gebruikt om de fractie van kleurstofmoleculen gebonden aan Ca2 + te kwantificeren. Helaas, de temporele jitteren van de pulsen en variaties in amplitude van puls-tot-puls kan zij de toepassing van deze experimentele strategie op gevallen waarin de verandering in fluorescentie door de ligandbinding aan de kleurstof groot.
Continuous Wave (CW) lasers worden meestal gebruikt als de belangrijkste lichtbron in LFFM (figuur 1b, CLFFM). De laserstraal kan continu branden het weefsel of kan ferroelektriciteit worden gemoduleerd. De ferroelektrische van de bundel maakt de generatie van microseconden lichtpulsen. Deze modulatie kan worden gecontroleerd door externe hardware. Deze procedure vermindert niet alleen drastisch tHij tijdelijke jitteren van lichtpulsen, maar maakt het ook mogelijk het mengen van bundels van verschillende golflengten. Het mengen van bundels gebeurt door multiplexen stralen van verschillende lasers. Bijgevolg kunnen meerdere kleurstoffen met verschillende spectrale eigenschappen worden opgewekt op de metingen van verschillende fysiologische variabelen te voeren, bijvoorbeeld Rhod-2 voor cytosolische Ca2 +, MagFluo4 voor intra-SR Ca2 + en di-8-ANEPPS voor membraanpotentiaal.
Hoewel lasers aanwezig zijn verschillende voordelen als lichtbron in LFFM, kunnen andere soorten lichtbronnen worden gebruikt, waaronder light-emitting diodes (LED's). In dit geval, de excitatie lichtbron bestond uit een InGaN LED (figuur 1c, PLEDFM). LEDs worden fotonen spontaan afgegeven wanneer elektronen uit de geleidingsband recombineren met gaten in de valentieband. Het verschil met solid-state lasers is dat de emissie niet gestimuleerd door andere fotonen. Dit resulteert in een niet-coherente bundel eneen bredere spectrale emissie voor LEDs.
Verschillende soorten high power LEDs kunnen worden gebruikt. AP opnamen behulp di-8-ANEPPS en Ca 2 + transiënten opgenomen middels Fluo-4 of Mag-Fluo-4, we een LED die een gemiddelde piek emissie bij 485 nm (blauw) en een halfwaardebreedte van 20 nm gebruikt (figuur 1d). Voor Ca2 + transiënten opgenomen met Rhod-2, de LED had een typische piek emissie bij 540 nm (groen) en een halfwaardebreedte van 35 nm (figuur 1d). LED's uitzenden in een band golflengte en vereisen daarom filters om hun spectrale emissie te beperken. Bovendien kan gepulseerd licht bij een frequentie van 1,6 kHz met een duur van 20 ps worden gegenereerd. De LED's werden gepulseerd met een snelle MOSFET veld effect transistor. Gelijktijdige opnamen met verschillende indicatoren kan worden uitgevoerd door multiplexen in de tijd de LED's. Helaas, licht uitgezonden door LED's moeilijker zijn om op een vezeloptische vergelijking met een laserbundel. Dus de belangrijkste nadeel van onsing LEDs is dat hun emissie profielen hoekverplaatsingen (± 15 °) van de hoofdas, en een extra optische worden gebruikt om dit te corrigeren.
In alle optische configuraties eerder beschreven, wordt het gereflecteerde excitatielicht met behulp van een dichroïsche spiegel. De bundel wordt vervolgens gefocusseerd door een asferische lens en een microscoopobjectief op een multimode glasvezel die is gepositioneerd op het weefsel. Volgens een epifluorescentie opstelling de dichroïsche spiegel dient ook om de excitatie scheiden van het uitgestraalde licht. Het uitgestraalde licht spectrum reist terug door een barrière filter om eventuele gereflecteerde excitatie verwijderen. Tenslotte wordt het uitgezonden licht zich een objectief op een fotodetector (figuur 1).
De transductie van licht naar elektrische stroom wordt uitgevoerd door silicium avalanche fotodiodes. Deze diodes hebben een snelle reactie en een hoge gevoeligheid waardoor weinig licht detectie. Defotostroom van de avalanche fotodiodes kan worden geamplificeerd in twee manieren: a transimpedantieversterker met een resistief terugkoppelelement (Figuur 1e) of door een integrator om actuele zetten in een spanning (Figuur 1f). Met de eerste benadering, de uitgangsspanning evenredig is met de fotostroom en de terugkoppelweerstand. Een typisch voorbeeld van de resistieve detectie van picoseconde laserpulsen wordt getoond in figuren 2a, 2b en 2c. Panel 2a illustreert de uitgang van de transimpedantieversterker en paneel 2b een tijdexpansie van de met een sterretje (*) interval. Een piekvolgende algoritme toegepast om de piek (rood) en de basis (groen) voor de fluorescente respons 12 te detecteren. De meting van de fluorescentie base bevat informatie van zowel de donkerstroom van de avalanche fotodiode en de storingen die bij omgevingstemperatuur light en elektromagnetische koppeling. Een weergave van pieken en basen is weergegeven in figuur 2c. Deze figuur toont de fluorescentie uitgezonden door de kleurstof (Rhod-2) gebonden aan Ca 2+ tijdens de cardiale cyclus van een kloppend hart parkiet.
In de tweede werkwijze wordt de uitgangsspanning van de integrator is een functie van de huidige en capacitieve terugkoppeling (figuur 2d, 2e en 2f). Figuur 2f toont twee opeenvolgende integratie cycli: de eerste met geen externe verlichting en de tweede met toegepaste lichtpulsen van een pulserende LED. Een gedetailleerde beschrijving wordt gegeven in de figuren 2g en 2h. Deze benadering, hoewel meer bewerkelijke, verschaft een grotere S / N door het ontbreken van thermische ruis in de terugkoppelcondensator. Het instrument bevat een timing stadium dat alle controle- en multiplexing van het excitatielicht genereert en beveelt de headstage integratie en reset perioden. Dit wordt meestal uitgevoerd met een digitale signaalverwerkingsschakeling die ook voert een digitale differentiatie van het geïntegreerde uitgangssignaal door het berekenen van een online regressie van de gegevens. Bij gebruik van een resistieve terugkoppeling, kan elke A / D acquisitie board gebruikt.
Tenslotte maken LFFM techniek is zeer veelzijdig en kan worden aangepast voor het opnemen van meer dan één gebied. Het toevoegen van een bundelsplitser in het lichtpad stelt ons in staat om het licht te splitsen in twee optische vezels. Elke optische vezel kan vervolgens op verschillende gebieden van een weefsel, onafhankelijk wekken en opnemen emissie van de exogene fluorescerende probes worden geplaatst. Deze wijziging stelt ons in om te beoordelen hoe anatomische regionale verschillen beïnvloeden fysiologische variabelen. Figuur 3 toont een bundelsplitser wordt gebruikt voor de CW excitatielicht zodat twee optische vezels worden gebruikt om transmurale elektrische of intracellulaire meten splitsen [Ca 2+] levels with minor-invasief. Transmurale signalen kunnen worden opgenomen door één vezel op het endocardium en de andere aan het epicard laag van de ventriculaire wand. Daarom is de LFFM techniek heeft het vermogen om het tijdsverloop van cellulaire signalen in verschillende regio meten en kan worden gebruikt om te testen of regionale veranderingen optreden onder pathologische omstandigheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit papier is gecentreerd beschrijven lokale gebied fluorescentie technieken om de functie van cardiale myocyten ex vivo te evalueren. Het onderzoek van deze cellen in een gekoppelde omgeving is niet alleen fysiologische, maar is ook zeer geschikt voor het beoordelen orgaan niveau pathologieën. De onderliggende cellulaire gebeurtenissen excitatie-contractie koppeling (ECC) kan worden vastgesteld op het gehele orgel niveau met behulp van moleculaire probes die intracellulaire Ca2 + dynamiek monitor (…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Alicia Mattiazzi voor kritische bespreking van het gepresenteerde werk. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (R01 HL-084487) aan ALE.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
Riferimenti
- Fabiato, A., Fabiato, F. Contractions induced by a calcium-triggered release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of single skinned cardiac cells. J Physiol. 249 (3), 469-495 (1975).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249 (5), 1056-1060 (1985).
- Escobar, A. L., et al. Developmental changes of intracellular Ca2+ transients in beating rat hearts. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), H971-H978 (2004).
- Ramos-Franco, J., Aguilar-Sanchez, Y., Escobar, A. L. Intact Heart Loose Patch Photolysis Reveals Ionic Current Kinetics During Ventricular Action Potentials. Circ Res. 118 (2), 203-215 (2016).
- Mitra, R., Morad, M. A uniform enzymatic method for dissociation of myocytes from hearts and stomachs of vertebrates. Am J Physiol. 249, H1056-H1060 (1985).
- Fischmeister, R., DeFelice, L. J., Ayer, R. K., Levi, R., DeHaan, R. L. Channel currents during spontaneous action potentials in embryonic chick heart cells. The action potential patch clamp. Biophys J. 46 (2), 267-271 (1984).
- Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Profile of L-type Ca(2+) current and Na(+)/Ca(2+) exchange current during cardiac action potential in ventricular myocytes. Heart Rhythm. 9 (1), 134-142 (2012).
- Apkon, M., Nerbonne, J. M. Characterization of two distinct depolarization-activated K+ currents in isolated adult rat ventricular myocytes. J Gen Physiol. 97 (5), 973-1011 (1991).
- Valverde, C. A., et al. Transient Ca2+ depletion of the sarcoplasmic reticulum at the onset of reperfusion. Cardiovasc Res. 85 (4), 671-680 (2010).
- Valverde, C. A., et al. Phospholamban phosphorylation sites enhance the recovery of intracellular Ca2+ after perfusion arrest in isolated, perfused mouse heart. Cardiovasc Res. 70 (2), 335-345 (2006).
- Escobar, A. L., et al. Role of inositol 1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 53 (6), 768-779 (2012).
- Mejía-Alvarez, R., et al. Pulsed local-field fluorescence microscopy: a new approach for measuring cellular signals in the beating heart. Pflügers Arch. 445 (6), 747-758 (2003).
- Ferreiro, M., Petrosky, A. D., Escobar, A. L. Intracellular Ca2+ release underlies the development of phase 2 in mouse ventricular action potentials. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (5), H1160-H1172 (2012).
- Kornyeyev, D., et al. Calsequestrin 2 deletion shortens the refractoriness of Ca2+ release and reduces rate-dependent Ca2+-alternans in intact mouse hearts. J Mol Cell Cardiol. 52 (1), 21-31 (2012).
- Mattiazzi, A., Argenziano, M., Aguilar-Sanchez, Y., Mazzocchi, G., Escobar, A. L. Ca2+ Sparks and Ca2+ waves are the subcellular events underlying Ca2+ overload during ischemia and reperfusion in perfused intact hearts. J Mol Cell Cardiol. 79, 69-78 (2015).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H2138-H2153 (2010).
- Wang, Z. G., Fermini, B., Nattel, S. Repolarization differences between guinea pig atrial endocardium and epicardium: evidence for a role of Ito. Am J Physiol. 260, H1501-H1506 (1991).
- Liu, D. W., Gintant, G. A., Antzelevitch, C. Ionic bases for electrophysiological distinctions among epicardial, midmyocardial, and endocardial myocytes from the free wall of the canine left ventricle. Circ Res. 72 (3), 671-687 (1993).
- Litovsky, S. H., Antzelevitch, C. Transient outward current prominent in canine ventricular epicardium but not endocardium. Circ Res. 62 (1), 116-126 (1988).
- Lukas, A. Electrophysiology of Myocardial Cells in the Epicardial, Midmyocardial, and Endocardial Layers of the Ventricle. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2 (1), 61-72 (1997).
- Antzelevitch, C., Fish, J. Electrical heterogeneity within the ventricular wall. Basic Res Cardiol. 96 (6), 517-527 (2001).
- Gomez, A. M. Modulation of electrical heterogeneity by compensated hypertrophy in rat left ventricle. Am J Physiol. 272 (3 Pt 2), H1078-H1086 (1997).
- Efimov, I. R. Innovation in optical imaging: looking inside the heart. Heart Rhythm. 4 (7), 925-926 (2007).
- Boukens, B. J., Efimov, I. R. A century of optocardiography. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 115-125 (2014).
- Zhang, H., Iijima, K., Huang, J., Walcott, G. P., Rogers, J. M. Optical mapping of membrane potential and epicardial deformation in beating hearts. Biophysics J. 111 (2), 438-451 (2016).
