दिल में, आणविक घटनाओं अंग की बिजली और सिकुड़ा समारोह समन्वय। स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी यहाँ प्रस्तुत तकनीकों का एक सेट बरकरार दिलों में सेलुलर चर की रिकॉर्डिंग में सक्षम बनाता है। हृदय समारोह को परिभाषित करने के लिए तंत्र की पहचान करना समझ में महत्वपूर्ण कैसे दिल रोग स्थितियों के तहत काम करता है।
दिल में, आणविक संकेत दे अध्ययन आमतौर पर पृथक myocytes में प्रदर्शन कर रहे हैं। हालांकि, इस तरह ischemia और arrhythmias के रूप में कई रोग स्थितियों केवल पूरी तरह से पूरे अंग स्तर पर समझा जा सकता है। यहाँ, हम स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LFFM) के स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि अक्षुण्ण दिल में सेलुलर संकेतों के माप की अनुमति देता प्रस्तुत करते हैं। तकनीक एक Langendorff perfused दिल और ऑप्टिकल फाइबर फ्लोरोसेंट संकेतों को रिकॉर्ड करने का एक संयोजन पर आधारित है। LFFM हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के क्षेत्र में विभिन्न अनुप्रयोगों के सामान्य और रोग की शर्तों के तहत दिल का अध्ययन करने के लिए है। एकाधिक हृदय चर अलग फ्लोरोसेंट संकेतक उपयोग पर नजर रखी जा सकती है। ये साइटोसोलिक [सीए 2 +], इंट्रा-sarcoplasmic जालिका [सीए 2 +] और झिल्ली क्षमता शामिल हैं। बहिर्जात फ्लोरोसेंट जांच उत्साहित हैं और उत्सर्जित प्रतिदीप्ति LFFM epifluorescence तकनीक के तीन अलग-अलग व्यवस्थाओं के साथ पायाइस अखबार में प्रस्तुत कर रहा है। इन तकनीकों के बीच केंद्रीय मतभेद उत्तेजना के लिए और जिस तरह से उत्तेजना प्रकाश संग्राहक है पर इस्तेमाल किया प्रकाश स्रोत के प्रकार हैं। स्पंदित LFFM (PLFFM) लेजर प्रकाश दालों का उपयोग करता है, जबकि निरंतर तरंग LFFM (CLFFM) उत्तेजना के लिए निरंतर लेजर प्रकाश का उपयोग करता है। अंत में, प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) एक तिहाई प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया। इस गैर सुसंगत व्यवस्था स्पंदित एलईडी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (PLEDFM) कहा जाता है।
दिल हृदय प्रणाली के केंद्रीय अंग है। दिल की संकुचन intracellular में वृद्धि [सीए 2 +] द्वारा शुरू की है। Intracellular सीए 2 रिलीज में बिजली के excitability और परिवर्तन के बीच संबंध ऐतिहासिक रूप enzymatically अलग कोशिकाओं 1, 2 में अध्ययन किया गया है। हालांकि, हृदय कोशिकाओं, विद्युत हैं पाचन और यंत्रवत्, 4 3 युग्मित। जब अलग-थलग, myocytes केवल शारीरिक रूप से uncoupled नहीं हैं, लेकिन विभिन्न परतों से myocytes हदबंदी 5 दौरान मिलाया जाता है। इसके अलावा, भारी लाभ है कि वोल्टेज क्लैंप की शर्तों के तहत अलग कक्षों के अध्ययन से उभरा है, 6, 7, 8 एक बिजली के संकोश alwa के रूप में दिल के स्वभाव के बावजूदवाईएस कैसे कार्यात्मक अलग ऊतक 3 में मौजूद लोगों से कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं के प्रश्न बन गया है।
इस पांडुलिपि में, हम अग्रिमों बरकरार दिल में स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LFFM) तकनीक के प्रयोग से हृदय शरीर क्रिया विज्ञान के ज्ञान में प्राप्त वर्णन है। LFFM फ्लोरोसेंट संकेतक का उपयोग करता है ऐसे साइटोसोलिक सीए 2, इंट्रा sarcoplasmic जालिका (एसआर) सीए 2 और झिल्ली क्षमता के रूप में कई शारीरिक चर को मापने के लिए। इन मापों एक साथ और संयोजन के रूप में वेंट्रिकुलर दबाव 9, 10, electrocardiograms 9, विद्युत कार्रवाई की क्षमता (ए पी एस), आयनिक वर्तमान रिकॉर्डिंग और बंदी यौगिकों 4 का फ्लैश photolysis, 11 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इन मापों करीब उच्च आवृत्तियों पर बरकरार दिल पेसिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैशारीरिक दरों को आर। हालांकि कई लेख 9, 11, 12, 13, 14 हमारे समूह LFFM तकनीक का उपयोग करके प्रकाशित किया गया है, इस तकनीक के साथ जुड़े तकनीकी जटिलताओं का अनुमान दिल और अन्य अंगों में पूर्व vivo शारीरिक घटना के अध्ययन में इसका बड़े पैमाने पर उपयोग को रोका गया है।
LFFM तकनीक (चित्रा 1) ऊतक के साथ संपर्क में एक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर का उपयोग कर प्राप्त epifluorescence माप के आधार पर किया जाता है। किसी भी संपर्क प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक की तरह, ऑप्टिकल संकल्प व्यास और फाइबर की संख्यात्मक एपर्चर (एनए) पर निर्भर करता है। फाइबर का एक एनए उच्च और छोटे व्यास माप के स्थानिक संकल्प में वृद्धि होगी। NAS और फाइबर व्यास क्रमश: 0.22 से 0.66 के लिए और 50 माइक्रोन के लिए 1 से मिमी लेकर कर सकते हैं। मेंएनए बढ़ती एक बड़ा ठोस कोण से आ फोटॉनों को स्वीकार कर शोर अनुपात (एस / एन) के लिए संकेत सुधार होगा। आदेश में एक epifluorescence डिवाइस के रूप में कार्य करने के लिए, प्रकाश किरण एक एस्फेरिक लेंस या एक epifluorescence उद्देश्य के साथ ऑप्टिकल फाइबर में ध्यान केंद्रित किया है जहां लेंस के एनए और फाइबर मैच। इस मिलान उत्तेजना के लिए और फोटॉनों fluorophore द्वारा उत्सर्जित वापस इकट्ठा करने के लिए ऊर्जा हस्तांतरण अधिकतम हो।
आदेश बहिर्जात फ्लोरोसेंट संकेतक के ऊतकों में भरी हुई उत्तेजित करने के लिए, अलग तरह के प्रकाश स्रोतों और रोशनी मोड में उपयोग किया जा सकता है। हमारे अग्रणी स्पंदित स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 3, 12 (PLFFM) का उपयोग अध्ययन एक कम लागत पीकोसैकन्ड लेजर (चित्रा 1 ए, PLFFM) कार्यरत हैं। प्रकाश स्रोत के इस प्रकार के काफी हद तक कारण डाई विरंजन के बिना रोमांचक रोशनी क्षेत्र के अंतर्गत fluorophore अणुओं का एक बड़ा अंश का बहुत बड़ा फायदा हैछोटी नाड़ी के लिए 12 durations। इसके अतिरिक्त, ultrashort दालों का उपयोग डाई 12 के प्रतिदीप्ति जीवन भर के मूल्यांकन की अनुमति दी। प्रतिदीप्ति जीवन भर एक संपत्ति है कि सीए 2 के लिए बाध्य डाई अणु के अंश यों इस्तेमाल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, नाड़ी करने वाली नाड़ी से दालों और आयाम में बदलाव के अस्थायी jittering मामलों को यह प्रयोगात्मक रणनीति जहां ligand डाई करने के लिए बाध्य द्वारा उत्पादित प्रतिदीप्ति में परिवर्तन बड़ी है के आवेदन की सीमा।
निरंतर तरंग (सीडब्ल्यू) लेज़रों आमतौर पर LFFM (चित्रा 1 बी, CLFFM) में मुख्य रोशनी स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। लेजर बीम लगातार ऊतक रोशन कर सकते हैं या ferroelectrically संग्राहक जा सकता है। किरण की ferroelectric मॉडुलन प्रकाश की microsecond दालों की पीढ़ी की अनुमति देता है। इस मॉडुलन बाहरी हार्डवेयर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। यह प्रक्रिया न केवल नाटकीय रूप से कम कर देता है टीवह प्रकाश दालों के अस्थायी jittering लेकिन यह भी मिश्रण अलग तरंग दैर्ध्य की कड़ियां अनुमति देता है। मुस्कराते हुए मिश्रण अलग लेज़रों से बहुसंकेतन किरणों द्वारा किया जाता है। एक परिणाम के रूप में, कई अलग अलग वर्णक्रमीय गुणों वाले रंगों उदाहरण के लिए, शारीरिक चर की एक किस्म की माप प्रदर्शन करने के लिए उत्साहित किया जा सकता है, Rhod-2 साइटोसोलिक सीए 2 के लिए, MagFluo4 इंट्रा-एसआर सीए 2 और di-8-ANEPPS के लिए के लिए झिल्ली क्षमता।
हालांकि LFFM में प्रकाश स्रोत के रूप में लेज़रों उपस्थित विभिन्न फायदे, प्रकाश स्रोतों के अन्य प्रकार के प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) सहित इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, उत्तेजना प्रकाश स्रोत एक InGaN एलईडी (चित्रा 1C, PLEDFM) शामिल थे। एल ई डी में, फोटॉनों अनायास उत्सर्जित कर रहे हैं जब चालन बैंड से इलेक्ट्रॉनों valence बैंड में छेद के साथ recombine। ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण के साथ अंतर यह है कि उत्सर्जन अन्य फोटॉनों से प्रेरित नहीं है। यह एक गैर-सुसंगत बीम में परिणाम औरएल ई डी के लिए एक व्यापक वर्णक्रम उत्सर्जन।
उच्च शक्ति एल ई डी के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Di-8-ANEPPS और सीए के लिए उपयोग कर एपी रिकॉर्डिंग के लिए 2 + यात्रियों का उपयोग कर Fluo 4 या सदस्यता Fluo 4, हम एक एलईडी 485 एनएम (नीला) और 20 एनएम के एक आधी चौड़ाई में एक ठेठ चोटी उत्सर्जन है कि इस्तेमाल किया दर्ज की (चित्रा -1)। सीए 2 Rhod-2 के साथ दर्ज की गई यात्रियों के लिए, एलईडी 540 एनएम (हरा) और 35 एनएम (चित्रा -1) की एक आधा चौड़ाई में एक ठेठ चोटी उत्सर्जन था। एल ई डी एक बैंड तरंग दैर्ध्य में फेंकना और इसलिए उनके वर्णक्रमीय उत्सर्जन को संकीर्ण करने के लिए फिल्टर की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, स्पंदित प्रकाश 20 μs की अवधि के साथ 1.6 किलो हर्ट्ज की दर से उत्पन्न किया जा सकता है। एल ई डी एक तेज शक्ति MOSFET क्षेत्र प्रभाव ट्रांजिस्टर के साथ स्पंदित कर रहे थे। विभिन्न संकेतकों के साथ एक साथ रिकॉर्डिंग समय-बहुसंकेतन एल ई डी द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, एल ई डी द्वारा उत्सर्जित प्रकाश एक लेजर बीम की तुलना में एक फाइबर ऑप्टिक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए और अधिक कठिन है। इस प्रकार, हम में से मुख्य दोषआईएनजी एलईडी कि उनके उत्सर्जन प्रोफाइल मुख्य धुरी से कोणीय विस्थापन (± 15 °) है, और एक सहायक ऑप्टिक यह सही करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए है।
ऑप्टिकल विन्यास पहले से वर्णित के सभी में, उत्तेजना प्रकाश एक dichroic दर्पण की सहायता से परिलक्षित होता है। किरण बाद में एक एस्फेरिक लेंस और एक माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए एक बहुपद्वति फाइबर ऑप्टिक कि ऊतक पर तैनात है पर से ध्यान केंद्रित किया है। किसी भी epifluorescence व्यवस्था के रूप में, dichroic दर्पण भी उत्सर्जित प्रकाश से उत्तेजना अलग करने के लिए कार्य करता है। उत्सर्जित प्रकाश स्पेक्ट्रम एक बाधा फिल्टर के माध्यम से वापस यात्रा किसी भी परिलक्षित उत्तेजना हटा दें। अंत में, प्रकाश उत्सर्जित एक photodetector (चित्रा 1) पर एक उद्देश्य के साथ ध्यान केंद्रित किया है।
बिजली चालू करने के लिए प्रकाश से पारगमन सिलिकॉन हिमस्खलन photodiodes द्वारा किया जाता है। ये डायोड एक तेजी से प्रतिक्रिया और एक उच्च कम प्रकाश का पता लगाने की इजाजत दी संवेदनशीलता है।हिमस्खलन photodiodes द्वारा उत्पादित photocurrent दो तरह से परिलक्षित किया जा सकता है: एक transimpedance एम्पलीफायर एक प्रतिरोधक प्रतिक्रिया तत्व (चित्रा 1E) कर रहे हैं या एक जोड़नेवाला द्वारा एक वोल्टेज (चित्रा 1F) में वर्तमान में परिवर्तित करने के लिए। पहले दृष्टिकोण का प्रयोग, उत्पादन में वोल्टेज photocurrent और राय संघर्ष के लिए आनुपातिक है। पीकोसैकन्ड लेजर दालों की प्रतिरोधक का पता लगाने का एक विशिष्ट उदाहरण आंकड़े 2A, 2 बी और -2 सी में दिखाया गया है। पैनल 2A transimpedance एम्पलीफायर के उत्पादन को दिखाता है और पैनल 2 बी अंतराल तारांकित (*) के साथ संकेत का एक समय विस्तार से पता चलता है। एक चोटी ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाएं 12 के लिए शिखर (लाल) और बेस (हरा) का पता लगाने के लिए लागू किया गया था। आधार प्रतिदीप्ति की माप परिवेश निम्न आय वर्ग द्वारा शुरू हिमस्खलन photodiode के अंधेरे वर्तमान और हस्तक्षेप दोनों की जानकारी प्रदान करता हैहिंदुस्तान टाइम्स और विद्युत चुम्बकीय युग्मन। चोटियों और अड्डों में से एक प्रतिनिधित्व चित्र -2 सी में दिखाया गया है। यह आंकड़ा प्रतिदीप्ति डाई (Rhod-2) एक मार तोता दिल के हृदय चक्र के दौरान 2 + सीए के लिए बाध्य द्वारा उत्सर्जित को दिखाता है।
दूसरी विधि में, करनेवाला के उत्पादन में वोल्टेज वर्तमान और capacitive प्रतिक्रिया का एक समारोह है (आंकड़े 2 डी, 2 ई, और 2 एफ)। कोई बाहरी रोशनी के साथ पहली और एक स्पंदित एलईडी से एप्लाइड प्रकाश दालों के साथ दूसरा: चित्रा 2 एफ लगातार दो एकीकरण चक्र चलता। एक विस्तृत वर्णन आंकड़े 2 जी और 2 में प्रस्तुत किया है। यह दृष्टिकोण है, हालांकि अधिक श्रमसाध्य, प्रतिक्रिया संधारित्र में थर्मल शोर के अभाव के कारण एक बड़ा एस / एन प्रदान करता है। साधन एक समय मंच है कि सभी नियंत्रण और उत्तेजना प्रकाश की बहुसंकेतन उत्पन्न करता है और headstage एकीकरण और Res आदेशों शामिलएट समय। यह आमतौर पर एक डिजिटल सिग्नल प्रोसेसिंग सर्किट भी है कि डेटा की एक ऑन लाइन प्रतिगमन कंप्यूटिंग द्वारा एकीकृत उत्पादन में संकेत की एक डिजिटल भेदभाव करता है के साथ किया जाता है। एक प्रतिरोधक प्रतिक्रिया उपयोग करने के मामले में, किसी भी ए / डी अधिग्रहण बोर्ड का इस्तेमाल किया जा सकता है।
अंत में, हमारे LFFM तकनीक बहुत बहुमुखी है और एक से अधिक क्षेत्र से रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रकाश पथ में एक बीम फाड़नेवाला जोड़ने से हमें दो ऑप्टिकल फाइबर में प्रकाश को विभाजित करने की अनुमति देता है। प्रत्येक ऑप्टिकल फाइबर तो एक ऊतक करने के लिए स्वतंत्र रूप से, उत्तेजित और exogenous फ्लोरोसेंट जांच से रिकॉर्ड उत्सर्जन के विभिन्न क्षेत्रों पर रखा जा सकता है। इस संशोधन का आकलन करने के लिए कैसे शारीरिक क्षेत्रीय मतभेद शारीरिक चर को प्रभावित हमें अनुमति देता है। चित्रा 3 सीडब्ल्यू उत्तेजना प्रकाश ऐसी है कि दो ऑप्टिकल फाइबर transmural बिजली या intracellular को मापने के लिए उपयोग किया जाता है विभाजित करने के लिए नियोजित किया जा रहा एक बीम फाड़नेवाला चलता [सीए 2 +] स्तरों बुद्धिज नाबालिग-invasiveness। ट्रांसमुरल संकेतों अंतर्हृदकला पर एक फाइबर और वेंट्रिकुलर दीवार की epicardium परत पर अन्य रखकर दर्ज किया जा सकता है। इसलिए, LFFM तकनीक अलग-अलग क्षेत्रों में सेलुलर संकेतों के समय पाठ्यक्रम उपाय करने की क्षमता है और अगर क्षेत्रीय परिवर्तन रोग स्थितियों के अंतर्गत होने परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस पत्र स्थानीय क्षेत्र प्रतिदीप्ति तकनीकों का वर्णन हृदय myocytes पूर्व vivo के समारोह का मूल्यांकन करने में केंद्रित है। एक युग्मित वातावरण में इन कोशिकाओं के अध्ययन से न केवल अधिक शारीरिक है, लेकिन यह ?…
The authors have nothing to disclose.
हम प्रस्तुत काम की महत्वपूर्ण चर्चा के लिए डॉ एलिसिया Mattiazzi धन्यवाद। यह काम एनआईएच से अनुदान द्वारा (R01 एच एल-084487) शराब के लिए समर्थन किया था।
Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
LabView | National Instruments | ||
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C |