Lokal Feltet Fluorescensmikroskopi: Imaging Cellular Signaler i Intakte Hearts

Summary

I hjertet, molekylære hendelser som koordinerer den elektriske og kontraktile funksjon av organet. Et sett av lokale felt fluorescens-mikroskopi teknikker som presenteres her muliggjør opptak av cellulære variabler i intakte hjertet. Identifisere mekanismer som definerer hjertefunksjonen er avgjørende for å forstå hvordan hjertet fungerer under patologiske situasjoner.

Abstract

I hjertet, er molekylsignaleringsstudier vanligvis utført i isolerte myocytter. Men mange patologiske tilstander slik som iskemi og arytmier kan bare bli fullt ut forstått på hele organet nivå. Her presenterer vi den spektroskopiske teknikk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) som tillater måling av cellulære signaler i intakt hjerte. Teknikken er basert på en kombinasjon av et Langendorff perfusert hjerte og optiske fibre for å ta opp fluorescente signalene. LFFM har ulike bruksområder innen kardiovaskulær fysiologi til å studere hjertet under normale og patologiske tilstander. Flere hjertevariabler kan overvåkes ved hjelp av ulike fluorescerende indikatorer. Disse inkluderer cytosolic [Ca ^2+], intra-sarkoplasmatisk retikulum [Ca ^2+] og membranpotensialer. De eksogene fluorescerende prober er spent og utsendt fluorescens påvises med tre forskjellige arrangementer av LFFM epifluorescence teknikks presentert i denne artikkelen. De sentrale forskjellene mellom disse teknikkene er av type lyskilde som brukes for eksitasjon og på vei eksitasjon lys moduleres. Den pulserende LFFM (PLFFM) bruker laser lyspulser mens kontinuerlig bølge LFFM (CLFFM) bruker kontinuerlig laserlys for eksitasjon. Endelig Lysdioder (LED) ble brukt som en tredje lyskilde. Denne ikke-koherent ordningen kalles pulset LED fluorescens mikroskopi (PLEDFM).

Introduction

Hjertet er det sentrale organet i det kardiovaskulære systemet. Hjertets sammentrekning blir initiert ved en økning i intracellulær [Ca2 ^+]. Forholdet mellom elektrisk oppstemthet og endringer i intracellulær Ca ²⁺ utgivelsen har vært historisk studert i enzymatisk dissosierte celler ^{1, 2.} Imidlertid, hjerteceller er elektrisk, metabolisk og mekanisk forbundet ^{tre, fire.} Når isolert, myocytes er ikke bare fysisk frakoplet, men myocytter fra forskjellige lag blandes i løpet av ⁵ dissosiasjon. Videre, til tross for de enorme fordelene som har dukket opp fra studiet av isolerte celler under spenning klemme forhold, ^{6, 7, 8} den iboende natur av hjertet som en elektrisk syncytium Always stiller spørsmålet om hvordan funksjonelt forskjellige dissosiert celler fra de som er tilstede i vevet ^tre.

I dette manuskriptet, beskriver vi fremskritt oppnådd i kunnskapen om hjertefysiologi ved bruk av lokale feltet fluorescens mikroskopi (LFFM) teknikker i intakt hjerte. LFFM bruker fluorescerende indikatorer for å måle flere fysiologiske variabler som cytosolic Ca ^2+, intra sarcoplasmic retikulum (ER) Ca ²⁺ og membranpotensialet. Disse målingene kan fås samtidig og i forbindelse med ventrikkel press ^{9, 10,} elektro ^9, elektriske aksjonspotensialer (APS), ioniske dagens opptak og flash fotolyse av bur forbindelser ^{4, 11.} I tillegg kan disse målingene oppnås ved pacing det intakte hjertet ved høyere frekvenser nærr til fysiologiske priser. Selv om flere artikler ^{9, 11, 12, 13, 14} har blitt publisert av vår gruppe ved hjelp LFFM teknikker, har den antagelse av tekniske kompleksiteten knyttet til denne teknikken hindret sin massive bruk i å studere ex vivo fysiologiske fenomener i hjertet og andre organer.

Den LFFM teknikk (figur 1) er basert på epifluorescens målinger oppnådd ved bruk av et multimodus optisk fiber er i kontakt med vevet. Som enhver kontakt fluorescens avbildningsteknikk avhenger den optiske oppløsning av diameteren og den numeriske apertur (NA) av fiberen. En høyere NA og mindre diameter av fiberen vil øke den romlige oppløsningen av målingene. NAS og fiberdiametere kan ligge i området 0,22 til 0,66 og fra 50 um til 1 mm, henholdsvis. Iskarpe bretter på NA vil forbedre signal-til-støy-forholdet (S / N) ved å ta imot fotoner som kommer fra en større romvinkel. For å virke som en epifluorescens-enhet, blir lysstrålen fokuseres til den optiske fiberen med en asfærisk linse eller et epifluorescens objektiv der NA av linsen og fiber match. Dette passer maksimerer energioverføringen for eksitasjon og for oppsamling tilbake fotonene som utsendes av fluoroforen.

For å opphisse eksogene fluorescerende indikatorer som er lagt i vevet, kan forskjellige lyskilder og belysningsmoduser utnyttes. Våre banebrytende studier med puls lokale feltet fluorescens mikros ^{3, 12} (PLFFM) ansatt en lav-kost picosecond laser (Figur 1a, PLFFM). Denne type lyskilde har den store fordelen av spennende en stor del av fluoroformolekyler under belysning område uten vesentlig bleking fargestoff grunnav den korte pulsvarigheter ^12. I tillegg er bruken av Ultra pulser tillot evaluering av fluorescens levetid av fargestoffet ^12. Fluorescens levetid er en egenskap som kan brukes til å kvantifisere brøkdel av fargestoffmolekyler bundet til Ca ^2+. Dessverre har den temporale jittering av pulsene og variasjoner i amplitude fra puls-til-puls begrense anvendelsen av denne eksperimentelle strategien til tilfeller hvor endringen i fluorescens som produseres av ligand binding til fargestoffet er stor.

Kontinuerlig bølge (CW) lasere er vanligvis brukt som den viktigste belysning kilde i LFFM (Figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerlig belyse vev eller kan ferroelectrically modulert. Den ferroelektriske modulering av strålen tillater generering av mikrosekunders pulser av lys. Denne modulasjon kan styres av ytre maskinvare. Denne prosedyren reduserer ikke bare dramatisk than temp jittering av lyspulser men tillater også blande bjelker av forskjellige bølgelengder. Blandingen av bjelkene gjøres ved multipleksing av stråler fra forskjellige lasere. Som en konsekvens, kan flere fargestoffer som har forskjellige spektrale egenskaper eksiteres for å utføre målinger av en rekke fysiologiske variable, for eksempel, Rhod-2 for cytosolisk Ca2 ^+, MagFluo4 for intra-SR Ca ²⁺ og di-8-ANEPPS for membranpotensialet.

Selv lasere presentere ulike fordeler som lyskilde i LFFM, kan andre typer lyskilder brukes blant annet lysdioder (LED). I dette tilfellet er det eksitasjonslyskilde besto av en InGaN LED (figur 1c, PLEDFM). I lysdioder, er fotoner spontant avgis når elektroner fra ledningsbåndet rekombinerer med hull i valensbåndet. Forskjellen med halvlederlasere er at utslipp ikke er stimulert av andre fotoner. Dette resulterer i en ikke-sammenhengende stråle oget bredere spektral utslipp for lysdioder.

Ulike typer kraftige LED kan brukes. For AP opptak med Di-8-ANEPPS og for Ca ^{2 +} transienter innspilt med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, vi brukte en LED som har en typisk topp emisjon ved 485 nm (blå) og en halv bredde på 20 nm (Figur 1d). For Ca ²⁺ transienter tatt opp med Rhod-2, lampen hadde en typisk maksimal emisjon ved 540 nm (grønn) og en halv bredde på 35 nm (figur 1d). LED avgir i et band bølgelengde og krever derfor filtrene til å begrense sin spektral utslipp. I tillegg kan pulset lys bli generert ved en hastighet på 1,6 kHz med en varighet på 20 us. Lysdiodene ble pulset med en rask strøm MOSFET felteffekttransistor. Samtidige innspillinger med ulike indikatorer kan utføres av tids multipleksing lysdiodene. Dessverre, er lyset som emitteres ved hjelp av LED mer vanskelig å fokusere på en fiberoptisk sammenlignet med en laserstråle. Dermed største ulempen med ossing LED er at utslippsprofiler har vinkelbevegelser (± 15 °) fra hovedaksen, og en ekstra optisk må brukes for å rette det opp.

I alle de optiske utforminger som tidligere er beskrevet, er eksitasjonslys som reflekteres ved hjelp av et dikroisk speil. Bjelken blir deretter fokuseres ved hjelp av en asfærisk linse og et mikroskopobjektiv til en flermodusfiberoptisk som er plassert på vevet. Som i enhver epifluorescens arrangement, det dikroiske speil tjener også til å skille magnetiseringen fra det utsendte lys. Det emitterte lys-spekteret reiser tilbake gjennom en barriere filter for å fjerne eventuelle gjenspeiles eksitasjon. Til slutt blir den utsendte lys fokusert med et objektiv på en fotodetektor (figur 1).

Transduksjon fra lys til elektrisk strøm er utført av silisium skredfotodioder. Disse diodene har en rask respons og høy følsomhet slik at lite lys gjenkjenning. Defotostrøm som produseres av skredfotodioder kan forsterkes på to måter: en transimpedansforsterker som har et motstandselement tilbakemelding (figur 1E), eller ved hjelp av en integrator for å omdanne strømmen til en spenning (figur 1f). Ved hjelp av den første fremgangsmåten, er utgangsspenningen proporsjonal med photo og tilbakekoplingsmotstanden. Et typisk eksempel på det resistive påvisning av picosecond laserpulser er vist i figurene 2a, 2b og 2c. Panel 2a illustrerer utgangen fra transimpedansforsterker og panel 2b viser en tid utvidelse av intervallet merket med en stjerne (*). En topp sporingsalgoritme ble gjennomført for å detektere topp (rød) og basen (grønn) for de fluorescerende responser ^12. Målingen av basen fluorescensen gir informasjon om både den mørkestrøm av skredfotodiode og interferenser innført ved omgivelses light og elektromagnetisk kobling. En representasjon av topper og baser er vist i figur 2c. Denne figuren illustrerer fluorescensen avgitt av det fargestoff (Rhod-2) bundet til Ca ²⁺ i løpet av hjertesyklusen av et bankende hjerte undulat.

I den andre fremgangsmåten, er utgangsspenningen fra integratoren en funksjon av strømmen og kapasitive tilbake (figurene 2d, 2e og 2f). Figur 2f viser to påfølgende integrasjons sykluser: den første uten ekstern belysning og andre med anvendt lyspulser fra en pulserende LED. En detaljert beskrivelse er gitt i figurene 2g og 2h. Denne fremgangsmåten, selv om mer arbeidskrevende og gir en større S / N på grunn av fravær av termisk støy i tilbakekoblings kondensator. Instrumentet har en timing scene som genererer all kontroll og multipleksing av eksitasjon lys og kommanderer heads integrering og resET perioder. Dette blir vanligvis utført med en digital signalbehandlingskrets som også utfører en digital differensiering av den integrerte utgangssignal ved å beregne en on-line regresjon av dataene. I tilfelle av anvendelse av en resistiv tilbake, kan en hvilken som helst A / D-anskaffelse brett anvendes.

Endelig er vår LFFM teknikk svært allsidig og kan tilpasses til å ta opp fra mer enn én region. Tilsetning av en stråledeler i lysbanen gjør det mulig for oss å splitte lyset i to optiske fibre. Hver optisk fiber kan deretter plasseres på forskjellige regioner i et vev til, uavhengig av hverandre, eksitere og ta opp emisjon fra eksogene fluorescerende prober. Denne endringen tillater oss å vurdere hvordan anatomiske regionale forskjeller påvirke fysiologiske variabler. Figur 3 viser en strålesplitter som anvendes for å splitte CW eksitasjonslyset slik at to optiske fibre anvendes for å måle transmural elektrisk eller intracellulær [Ca2 ^+] nivåer vetth moll-invasivitet. Transmuralt signaler kan tas opp ved å plassere en fiber på endocardium og den andre på epikardet laget av ventrikkel veggen. Derfor har LFFM teknikk evnen til å måle tidsforløpet av cellulære signaler i forskjellige regioner, og kan brukes for å teste om regionale endringer skje under patologiske situasjoner.

Protocol

Denne protokollen og alle mus håndtering ble godkjent av UC Merced Institutional Animal Care og bruk Committee (No. 2008-201). Eksperimenter med parakitter ble gjennomført i 1999 i henhold til generelle retningslinjer for bruk av dyr etablert av den vitenskapelige provisjon av den venezuelanske Institute for Scientific Research (Ivic). 1. Langendorff Set Up Forberedelse Fremstille Tyrode-oppløsning inneholdende følgende oppløste konsentrasjoner i mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 <sub…

Representative Results

AP og Ca 2+ transienter i endocardium og epikardet For å sammenligne signaler over den ventrikulære veggen, er en fiberoptisk plassert i endocardium og den andre i epikardet. Sammenligning morfologien til en AP registreres fra endocardium med en fra epikardet er den beste måte å vurdere transmuralt funksjon. Ventrikkel veggen er svært heterogen og dermed morfologi…

Discussion

Dette papiret er sentrert i beskriver lokale felt fluorescens teknikker for å evaluere funksjonen av hjertemuskelceller ex vivo. Studiet av disse cellene i en koplet miljø er ikke bare mer fysiologiske, men er også svært egnet for vurdering av organ-nivå patologier. De cellulære hendelser som ligger til grunn eksitasjons-kontraksjon kobling (ECC) kan evalueres ved hele organet nivå med bruk av molekylære prober som overvåker intracellulære Ca2 ⁺ dynamikk (Rhod 2 cytosolisk Ca2 ^+,…

Materials

Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2um nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20×13
60mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6"x6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4'x6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25mmx75mmx10mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C