El campo local microscopía de fluorescencia: Imágenes señales celulares en los corazones intactos
Summary
En el corazón, los eventos moleculares coordinan la función eléctrica y contráctil del órgano. Un conjunto de técnicas de microscopía de fluorescencia de campo locales que aquí se presenta permite el registro de las variables celulares en los corazones intactos. La identificación de los mecanismos que definen la función cardíaca es fundamental para entender cómo el corazón trabaja en situaciones patológicas.
Abstract
En el corazón, los estudios moleculares de señalización se realizan generalmente en miocitos aislados. Sin embargo, muchas situaciones patológicas tales como la isquemia y las arritmias sólo pueden comprenderse por completo en todo el nivel de órganos. A continuación, presentamos la técnica de espectroscopia de fluorescencia local de microscopía de campo (LFFM) que permite la medición de señales celulares en el corazón intacto. La técnica se basa en una combinación de un corazón perfundido Langendorff y fibras ópticas para registrar señales fluorescentes. LFFM tiene varias aplicaciones en el campo de la fisiología cardiovascular para estudiar el corazón bajo condiciones normales y patológicas. las variables cardiacas múltiples pueden ser controlados utilizando diferentes indicadores fluorescentes. Estos incluyen citosólico [Ca 2 +], el retículo sarcoplásmico intra-[Ca2 +] y los potenciales de membrana. Las sondas fluorescentes se excitan exógenos y la fluorescencia emitida detectaron con tres modalidades diferentes de la técnica LFFM epifluorescencias presentado en este documento. Las diferencias centrales entre estas técnicas son el tipo de fuente de luz utilizada para la excitación y en el camino se modula la luz de excitación. El LFFM pulsado (PLFFM) utiliza pulsos de luz láser de onda continua, mientras que LFFM (CLFFM) utiliza luz láser para la excitación continua. Por último, diodos emisores de luz (LEDs) se utilizaron como fuente de luz tercera. Esta disposición no coherente se llama pulsada microscopía de fluorescencia LED (PLEDFM).
Introduction
El corazón es el órgano central del sistema cardiovascular. La contracción del corazón se inicia por un aumento de intracelular [Ca 2 +]. La relación entre la excitabilidad eléctrica y los cambios en la liberación de Ca2 + intracelular ha sido históricamente estudiado en células disociadas enzimáticamente 1, 2. Sin embargo, las células cardiacas son eléctricamente, metabólicamente y mecánicamente acoplados 3, 4. Cuando aislada, los miocitos no son sólo físicamente desacoplado, pero miocitos de las diferentes capas se mezclan durante la disociación 5. Por otra parte, a pesar de las enormes ventajas que han surgido a partir del estudio de las células aisladas en condiciones de tensión de la abrazadera, 6, 7, 8 la naturaleza intrínseca del corazón como un sincitio eléctrica always plantea la cuestión de cómo funcionalmente diferentes son células disociadas de los presentes en el tejido 3.
En este manuscrito, se describen los avances obtenidos en el conocimiento de la fisiología cardiaca mediante el uso de técnicas de microscopía de campo local de la fluorescencia (LFFM) en el corazón intacto. LFFM utiliza indicadores fluorescentes para medir múltiples variables fisiológicas tales como Ca2 + citosólico, intra retículo sarcoplásmico (SR) Ca2 + y el potencial de membrana. Estas mediciones se pueden obtener de forma simultánea y en conjunción con la presión ventricular 9, 10, electrocardiogramas 9, los potenciales de acción eléctricos (APs), grabaciones de corriente iónica y la fotólisis de destello de compuestos enjaulados 4, 11. Además, estas mediciones pueden obtenerse por estimular el corazón intacto a frecuencias más altas cercar a las tasas fisiológicas. Aunque varios artículos 9, 11, 12, 13, 14 han sido publicados por nuestro grupo utilizando técnicas LFFM, la presunción de complejidades técnicas asociadas con esta técnica ha impedido su uso masivo en el estudio de los fenómenos fisiológicos ex vivo en el corazón y otros órganos.
La técnica LFFM (Figura 1) se basa en mediciones de epifluorescencia obtenidos utilizando una fibra óptica multimodo en contacto con el tejido. Como cualquier técnica de imagen de contacto de fluorescencia, la resolución óptica depende del diámetro y la apertura numérica (NA) de la fibra. Un diámetro mayor NA y más pequeño de la fibra aumenta la resolución espacial de las mediciones. AN y diámetros de fibra pueden variar desde 0,22 hasta 0,66 y de 50 micras a 1 mm, respectivamente. Enarrugar la AN mejorar la relación señal a ruido (S / N) mediante la aceptación de los fotones que llegan desde un ángulo sólido más grande. Con el fin de actuar como un dispositivo de epifluorescencia, el haz de luz se enfoca en la fibra óptica con una lente asférica o un objetivo de epifluorescencia en el que el NA de la lente y el partido de la fibra. Esta coincidencia maximiza la transferencia de energía para la excitación y para recoger de nuevo los fotones emitidos por el fluoróforo.
Con el fin de excitar los indicadores fluorescentes exógenos cargados en el tejido, diferentes fuentes de luz y modos de iluminación pueden ser utilizados. Nuestros estudios pioneros de impulsos utilizando el campo local de la microscopía de fluorescencia 3, 12 (PLFFM) emplean un láser de bajo costo de picosegundos (Figura 1a, PLFFM). Este tipo de fuente de luz tiene la enorme ventaja de excitar una gran fracción de moléculas de fluoróforo en el marco del área de iluminación y sin blanquear sustancialmente el tinte debidoal impulso corto duraciones 12. Además, el uso de pulsos ultracortos permitió la evaluación de la vida de la fluorescencia del colorante 12. El tiempo de vida de fluorescencia es una propiedad que se puede usar para cuantificar la fracción de moléculas de colorante unidas a Ca2 +. Desafortunadamente, el jittering temporal de los impulsos y las variaciones de amplitud de pulso a pulso limitar la aplicación de esta estrategia experimental para los casos en que el cambio en la fluorescencia producida por la unión al colorante ligando es grande.
Wave (CW) láseres continuos se utilizan generalmente como la fuente de iluminación principal en LFFM (Figura 1b, CLFFM). El rayo láser puede iluminar de forma continua el tejido o puede ser modulada ferroelectrically. La modulación ferroeléctrico del haz permite la generación de pulsos de microsegundos de la luz. Esta modulación puede ser controlado por hardware externo. Este procedimiento no sólo reduce drásticamente tque jittering temporal de impulsos de luz, sino también permite que los haces de diferentes longitudes de onda de mezclado. La mezcla de vigas se realiza mediante multiplexación rayos de diferentes láseres. Como consecuencia de ello, múltiples colorantes que tienen diferentes propiedades espectrales pueden ser excitados para llevar a cabo las mediciones de una variedad de variables fisiológicas, por ejemplo, Rhod-2 para citosólica de Ca2 +, MagFluo4 para Ca-intra SR 2+ y di-8-ANEPPS para Potencial de membrana.
Aunque los láseres presentan varias ventajas como la fuente de luz en LFFM, otros tipos de fuentes de luz se pueden utilizar incluyendo diodos emisores de luz (LEDs). En este caso, la fuente de luz de excitación consiste en un LED InGaN (Figura 1c, PLEDFM). En LEDs, los fotones son emitidos espontáneamente cuando los electrones de la banda de conducción se recombinan con los agujeros en la banda de valencia. La diferencia con los láseres de estado sólido es que la emisión no es estimulada por otros fotones. Esto resulta en un haz no coherente yuna emisión espectral más amplio para LEDs.
Diferentes tipos de LED de alta potencia pueden ser utilizados. Para grabaciones AP utilizando Di-8-ANEPPS y para el Ca 2 + transitorios registraron usando Fluo-4 o Mag-Fluo-4, se utilizó un LED que tiene un pico de emisión típica en 485 nm (azul) y una anchura media de 20 nm (Figura 1d). Para Ca 2 + transitorios grabados con Rhod-2, el LED tenía un pico de emisión típico a 540 nm (verde) y una anchura media de 35 nm (Figura 1d). LED emiten una longitud de onda en banda y por lo tanto requieren filtros para limitar su emisión espectral. Además, la luz pulsada se puede generar a una velocidad de 1,6 kHz, con una duración de 20 mu s. Los LED se pulsaron con una rápida MOSFET de potencia del transistor de efecto de campo. grabaciones simultáneas con diferentes indicadores pueden ser realizadas por el tiempo de multiplexado de los LEDs. Desafortunadamente, la luz emitida por los LEDs es más difícil de enfocar en una fibra óptica en comparación con un haz láser. Por lo tanto, el principal inconveniente de nosotrosing LEDs es que sus perfiles de emisión tienen desplazamientos angulares (± 15 °) con respecto al eje principal, y una óptica auxiliar se deben utilizar para corregirlo.
En todas las configuraciones ópticas descrito anteriormente, la luz de excitación se refleja con la ayuda de un espejo dicroico. El haz se enfoca posteriormente por una lente asférica y un objetivo de microscopio sobre una fibra óptica multimodo que se coloca sobre el tejido. Como en cualquier disposición de epifluorescencia, el espejo dicroico también sirve para separar la excitación de la luz emitida. El espectro de la luz emitida viaja de nuevo a través de un filtro de barrera para eliminar cualquier excitación reflejada. Por último, la luz emitida es enfocada con un objetivo en un fotodetector (Figura 1).
La transducción de la luz a la corriente eléctrica se realiza mediante fotodiodos de avalancha de silicio. Estos diodos tienen una respuesta rápida y una alta sensibilidad que permite la detección de poca luz. losfotocorriente producida por los fotodiodos de avalancha puede ser amplificada en dos formas: un amplificador de transimpedancia que tiene un elemento de realimentación resistiva (Figura 1e) o por un integrador para convertir la corriente en una tensión (Figura 1f). Usando el primer enfoque, la tensión de salida es proporcional a la fotocorriente y la resistencia de realimentación. Un ejemplo típico de la detección de resistencia de pulsos de láser de picosegundos se muestra en las Figuras 2a, 2b y 2c. Panel 2a ilustra la salida del amplificador de transimpedancia y el panel 2b muestra una expansión en el tiempo del intervalo indicado con un asterisco (*). Un algoritmo de rastreo de picos se llevó a cabo para detectar el pico (rojo) y la base (verde) para las respuestas fluorescentes 12. La medición de la fluorescencia de base proporciona información tanto de la corriente oscura del fotodiodo de avalancha y las interferencias introducido por lig ambienteht y acoplamiento electromagnético. Una representación de picos y bases se muestra en la Figura 2c. Esta figura ilustra la fluorescencia emitida por el tinte (Rhod-2) unido a Ca 2+ durante el ciclo cardíaco de un corazón que late periquito.
En el segundo método, la tensión de salida del integrador es una función de la realimentación de corriente y capacitiva (figuras 2d, 2e, y 2f). Figura 2f muestra dos ciclos consecutivos de integración: el primero sin la iluminación interior y la segunda con pulsos de luz aplicada desde un LED pulsada. Una descripción detallada se presenta en las Figuras 2G y 2H. Este enfoque, aunque más laborioso, proporciona una mayor S / N debido a la ausencia de ruido térmico en el condensador de realimentación. El instrumento incluye una etapa de temporización que genera todo el control y la multiplexación de la luz de excitación y los comandos de la integración cabezal de la platina y reset períodos. Esto se realiza por lo general con un circuito de procesamiento de señal digital que también realiza una diferenciación digital de la señal de salida integrado mediante el cálculo de una regresión en línea de los datos. En el caso de utilizar una realimentación resistiva, cualquier tarjeta de adquisición de A / D se puede utilizar.
Finalmente, nuestra técnica LFFM es muy versátil y puede adaptarse para grabar desde más de una región. La adición de un divisor de haz en el camino de la luz nos permite dividir la luz en dos fibras ópticas. Cada fibra óptica entonces se puede colocar en diferentes regiones de un tejido que, independientemente, excitar y emisión registro de las sondas fluorescentes exógenos. Esta modificación nos permite evaluar la forma anatómica diferencias regionales influyen en las variables fisiológicas. La Figura 3 muestra un divisor de haz que se emplea para dividir la luz de excitación CW tal que dos fibras ópticas se utilizan para medir transmural intracelular eléctrico o [Ca2 +] niveles ingenioh menor invasividad. señales transmurales se pueden grabar mediante la colocación de una fibra en el endocardio y el otro en la capa de epicardio de la pared ventricular. Por lo tanto, la técnica LFFM tiene la capacidad de medir la evolución temporal de señales celulares en diferentes regiones y se puede utilizar para probar si los cambios regionales se producen en situaciones patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este documento se centra en la descripción de las técnicas de fluorescencia de campo de la zona para evaluar la función de los miocitos cardíacos ex vivo. El estudio de estas células en un medio ambiente junto no sólo es más fisiológica, pero también es muy adecuado para evaluar patologías a nivel de órganos. Los eventos celulares que subyacen acoplamiento excitación-contracción (ECC) se pueden evaluar en todo el nivel de órganos con el uso de sondas moleculares que controlan la dinámica de<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Alicia Mattiazzi para la discusión crítica de los trabajos presentados. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (R01 HL-084487) para ALE.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | 7647-14-5 | |
| D-(+)-glucose | Sigma | 50-99-7 | |
| Potassium chloride | Sigma | 7447-40-7 | |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | |
| Sodium phosphate | Sigma | 10049-21-5 | |
| Calcium chloride solution | Sigma | 10043-52-4 | |
| Magnesium chloride solution | Sigma | 7786-30-3 | |
| Sodium hyrdoxide | Sigma | S-8045 | |
| 0.2um nylon membrane filter | Whatman | 7402-004 | |
| Manifold MPP | Warner | 64-0216 | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture) | AllMech Tech | LOOK-SP105 | |
| Heparin sodium injection 1000USP/mL | AllMech Tech | NDC63323-540-11 | |
| DMSO D8779 | Sigma | 67-68-5 | |
| Blebbistatin | Sigma | 856925-71-8 | |
| Pluronic F-127 20% solution | Biotium | 59004 | |
| Materflex C/L peristaltic pump | Cole-Parmer | 77122-26 | |
| Isostim stimulator | World Precision Instruments | A320RC | |
| Waveform generator | Teledyne Lecroy | WaveStation 2012 | |
| Ultrasonic cleaner FS20 | Fisher Scientific | 1533530 | |
| Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-031A | |
| Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32" | Component Supply | TET-094A | |
| Adapter luer lock to 3-way valve | Cole-Parmer | EW-31200-80 | |
| Tee adapters and plastic fittings | Cole-Parmer | 6365-90 | |
| Plastic clamp | WaterZoo | 2465 | |
| Peltier | TE Technology | TE-127-2.0-2.5 | |
| Rhod-2AM | ThermoFisher Scientific | R1245MP | |
| Di-8-ANEPPS | ThermoFisher Scientific | D3167 | |
| Mag-Fluo-4AM | ThermoFisher Scientific | M14206 | |
| Acupunture needles | LHASA | TC1.20×13 | |
| 60mL BD syringe with luer-lok | Fisher Scientific | 14-820-11 | |
| LabView | National Instruments | ||
| Speed vacuum Eppendorf Vagufuge | Fisher Scientific | 07-748-13 | |
| Digital signal processing circuit DSP TMS 320 | Texas Instrument | ||
| Longpass Dichroic mirror 567nm | ThorLabs | DMLP567L | |
| Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-437 | |
| Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective | Edmund Optics | Stock# 33-438 | |
| Longpass colored glass filter 590 nm | ThorLabs | FGL590 | |
| Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW | |||
| Micromanipulator for laser | Siskiyou | MX130R | |
| Multimode fiber optic 200µm NA 0.39 | ThorLabs | FT200UMT | |
| LEDs blue | Lumileds | L135-B475003500000 | |
| LEDs green | Lumileds | L135-G525003500000 | |
| Cube beam splitter, non-polarizing | ThorLabs | BS007 | |
| 36" Length, Dovetail Optical Rail | Edmund Optics | 54-402 | |
| 2.5" Width, Dovetail Carrier | Edmund Optics | 54-404 | |
| 0.75" Travel, micrometer stage | Edmund Optics | 37-983 | |
| Dovetail optical rail 3" | ThorLabs | RLA075/M | |
| Dovetail rail carrier 1" | ThorLabs | RC1 | |
| Avalanche photodiode Helix 902 | Digi-Key | HELIX-902-200 | |
| Objective holder XY Translator | ThorLabs | ST1XY-S | |
| Aluminum breadboard 6"x6" | ThorLabs | MB6 | |
| Nexus otpical table 4'x6' | ThorLabs | T46HK | |
| Stainless steel cap screws | ThorLabs | HW-KIT5/M | |
| Acrylic sheet | Home Depot/Lowes | ||
| Sylgard Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy gel | Walmart/Home Depot | 2-part 5 min clr 1oz | |
| 21G1.5 Precision glide needle | B-D | 305167 | |
| 23G Precision glide needle | B-D | 305145 | |
| Mounting base, 25mmx75mmx10mm | ThorLabs | BA1/M | |
| Wire shelve posts 36" | Alera | AALESW59PO36SR | |
| Wire shelves | Alera | ALESW582424SR | |
| Post and angle clamp | ThorLabs | SWC/M-P5 | |
| Glass syringe for dye chamber | Wheaton | W851020 | |
| Rubber stopper | Home Science Tools | CE-STOP01C | |
Riferimenti
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