Lokal Field fluorescensmikroskopi: Imaging mobilsignalerna i intakta hjärtan

Summary

I hjärtat, molekylära händelser samordna elektriska och kontraktila funktion av organet. En uppsättning av lokala fält fluorescensmikroskopi tekniker som presenteras här möjliggör inspelningen av cellulära variabler i intakta hjärtan. Identifiera mekanismer som definierar hjärtfunktion är viktiga för att förstå hur hjärtat fungerar under patologiska situationer.

Abstract

I hjärtat är molekylära signal studier vanligtvis i isolerade myocyter. Men många patologiska situationer såsom ischemi och arytmier kan endast till fullo förstås vid hela organnivå. Här presenterar vi den spektroskopiska teknik för lokal fält fluorescensmikroskopi (LFFM) som möjliggör mätning av cellulära signaler i den intakta hjärtat. Tekniken är baserad på en kombination av en Langendorff perfusion hjärta och optiska fibrer för att spela in fluorescerande signaler. LFFM har olika tillämpningar inom kardiovaskulär fysiologi att studera hjärtat under normala och patologiska tillstånd. Flera hjärt variabler kan övervakas med hjälp av olika fluorescerande indikatorer. Dessa inkluderar cytosolisk [Ca2 ^+], intra-sarko nätmagen [Ca2 ^+] och membranpotentialer. De exogena fluorescerande prober är glada och den emitterade fluorescensen detekterades med tre olika arrangemang av LFFM epifluorescence tekniks presenteras i detta dokument. De centrala skillnader bland dessa tekniker är den typ av ljuskälla som används för excitering och på vägen excitationsljuset moduleras. Den pulsade LFFM (PLFFM) använder laserljuspulser medan kontinuerlig våg LFFM (CLFFM) använder kontinuerligt laserljus för excitering. Slutligen tillsattes Ijusemitterande dioder (LED) används som en tredje ljuskälla. Denna icke-koherent arrangemang kallas pulse LED fluorescensmikroskopi (PLEDFM).

Introduction

Hjärtat är den centrala organ i det kardiovaskulära systemet. Hjärtats kontraktion initieras av en ökning av intracellulär [Ca2 ^+]. Förhållandet mellan elektriska retbarhet och förändringar i intracellulär Ca2 ⁺ frisättning har historiskt studerats i enzymatiskt dissocierade celler ^{1, 2.} Emellertid hjärtceller är elektriskt, metaboliskt och mekaniskt kopplade ^{3, 4.} När isolerade, de myocyter är inte bara fysiskt ansluten, men myocyter från olika skikt blandas under dissociation ^5. Dessutom, trots de enorma fördelar som framkommit i studien av isolerade celler under spänningsklämförhållanden, ^{6, 7, 8} inneboende karaktären av hjärtat som en elektrisk syncytium always ställer frågan om hur funktionellt olika dissocieras celler från de som finns i vävnaden ^tre.

I detta manuskript, beskriver vi de framsteg som erhållits i kunskapen om hjärtats fysiologi med hjälp av lokala fält fluorescensmikroskopi (LFFM) tekniker i den intakta hjärtat. LFFM använder fluorescerande indikatorer för att mäta flera fysiologiska variabler såsom cytosoliskt Ca2 ^+, intra sarko nätmagen (SR) Ca ²⁺ och membranpotential. Dessa mätningar kan erhållas samtidigt och i samband med kammartryck ^{9, 10,} elektrokardiogram ^9, elektriska aktionspotentialer (APS), joniska ström inspelningar och flash fotolys av bur föreningarna ^{4, 11.} Dessutom kan dessa mätningar erhållas genom pacing den intakta hjärtat vid högre frekvenser närar till fysiologiska priser. Även flera artiklar ^{9, 11, 12, 13, 14} har publicerats av vår grupp använder LFFM tekniker har antagandet av tekniska komplikationer i samband med denna teknik förhindras sin massiva användning studera ex vivo fysiologiska fenomen i hjärtat och andra organ.

Den LFFM tekniken (figur 1) är baserat på epifluorescence mätningar erhållna med användning av en optisk multimodfiber i kontakt med vävnaden. Precis som alla kontakt fluorescens bildteknik, den optiska upplösningen beror på diametern och den numeriska aperturen (NA) hos fibern. En högre NA och mindre diameter hos fibern kommer att öka den rumsliga upplösningen av mätningarna. NAS och fiberdiametrar kan sträcka sig från 0,22 till 0,66 och från 50 | im till 1 mm, respektive. Iskrynklas NA kommer att förbättra signalbrusförhållandet (S / N) genom att acceptera fotoner som anländer från en större rymdvinkel. För att fungera som en epifluorescence enhet, är ljusstrålen fokuseras i den optiska fibern med en asfärisk lins eller en epifluorescence mål där NA av linsen och fibern matchen. Denna matchning maximerar energiöverföringen för excitation och för att samla tillbaka fotoner som avges av fluoroforen.

För att excitera de exogena fluorescerande indikatorer laddade i vävnaden, kan olika ljuskällor och belysningslägen användas. Våra banbrytande studier med den pulsade lokala fältet fluorescensmikroskopi ^{3, 12} (PLFFM) använde en låg kostnad pikosekund laser (Figur 1a, PLFFM). Denna typ av ljuskälla har stor fördel av spännande en stor del av fluoroforen molekyler under belysningsområdet utan att väsentligen blekning av färgämnet på grundtill den korta pulsvaraktigheter ^12. Dessutom, användningen av ultrakorta pulser tillät bedömning av fluorescenslivstid av färgämnet ^12. Den fluorescenslivstid är en egenskap som kan användas för att kvantifiera den fraktion av färgämnesmolekyler bundna till Ca ^{2 +.} Tyvärr, den tidsmässiga bilden darrar av pulserna och variationer i amplitud från puls-till-puls begränsa tillämpningen av denna experimentella strategi till fall där förändring i fluorescens som produceras av ligandbindning till färgämnet är stort.

Kontinuerlig våg (CW) lasrar används vanligen som huvudbelysningskällan i LFFM (figur 1b, CLFFM). Laserstrålen kan kontinuerligt belysa vävnaden eller kan ferroelectrically moduleras. Det ferroelektriska modulering av strålen tillåter alstring av mikrosekunders pulser av ljus. Denna modulering kan kontrolleras genom extern hårdvara. Detta förfarande minskar inte bara dramatiskt than temporal flimret av ljuspulser utan gör det också möjligt att blanda strålar av olika våglängder. Blandningen av balkarna sker genom multiplexering av strålar från olika lasrar. Som en följd av detta kan flera färgämnen med olika spektrala egenskaper vara glada att utföra mätningar av olika fysiologiska variabler, till exempel, Rhod-2 för cytosoliskt Ca2 ^+, MagFluo4 för intra-SR Ca ^{2 +} och di-8-ANEPPS för membranpotential.

Fastän lasrar är närvarande olika fördelar som ljuskälla i LFFM, kan andra typer av ljuskällor användas innefattande Ijusemitterande dioder (LED). I detta fall bestod excitationsljuset källa för en InGaN lysdiod (fig 1c, PLEDFM). I lysdioder, är fotoner spontant emitteras när elektroner från ledningsbandet rekombinerar med hål i valensbandet. Skillnaden med solid-state laser är att utsläppen inte stimuleras av andra fotoner. Detta resulterar i en icke-koherent stråle ochen bredare spektralemission för lysdioder.

Olika typer av hög effekt lysdioder kan användas. För AP inspelningar med Di-8-ANEPPS och Ca ^{2 +} transienter som spelats in med Fluo-4 eller Mag-Fluo-4, använde vi en lysdiod som har en typisk toppemission vid 485 nm (blå) och en halv bredd av 20 nm (figur 1d). För Ca2 ⁺ transienter som spelats in med Rhod-2, hade lysdioden en typisk toppemission vid 540 nm (grön) och en halv bredd av 35 nm (figur 1d). Lysdioder avger i ett band våglängd och därför kräver filter för att begränsa deras spektrala utsläpp. Dessutom kan pulserat ljus alstras med en hastighet av 1,6 kHz med varaktigheten av 20 ^ s. Lysdioderna pulserades med en snabb effekt-MOSFET fälteffekttransistor. Samtidiga inspelningar med olika indikatorer kan utföras genom tidsmultiplexering lysdioderna. Tyvärr, är ljus som sänds ut av lysdioder mer svårt att fokusera på en fiberoptisk jämfört med en laserstråle. Således, den stora nackdelen av ossing lysdioder är att deras utsläppsprofiler har vinkelförskjutningar (± 15 °) från huvudaxeln, och en extra optisk måste användas för att rätta till det.

I alla de optiska konfigurationer som tidigare beskrivits, är exciteringsljuset reflekteras med hjälp av en dikroisk spegel. Strålen därefter fokuseras av en asfärisk lins och ett mikroskopobjektiv på en multimode fiberoptisk som är placerad på vävnaden. Som i alla epifluorescence arrangemang, den dikroiska spegeln tjänar också till att separera excitering från det utsända ljuset. Det emitterade ljuset spektrum färdas tillbaka genom ett spärrfilter för att avlägsna eventuellt reflekterade excitering. Slutligen är det emitterade ljuset fokuseras med ett mål på en fotodetektor (Figur 1).

Transduktionen från ljus till elektrisk ström utförs genom kisellavinfotodioder. Dessa dioder har en snabb respons och hög känslighet gör det möjligt svagt ljus upptäckt. Defotoström som alstras av lavinfotodioder kan amplifieras på två sätt: en transimpedansförstärkare som har ett resistivt återkopplingselement (Figur 1e) eller av en integrator för att omvandla strömmen till en spänning (figur 1f). Med användning av den första metoden, är utspänningen som är proportionell mot fotoströmmen och återkopplingsmotståndet. Ett typiskt exempel på den resistiva detektering av pikosekund laserpulser visas i figurerna 2a, 2b och 2c. Panel 2a illustrerar utsignalen från transimpedansförstärkaren och panel 2b visar en tidsexpansion av intervallet indikeras med en asterisk (*). En topp spårning algoritm genomfördes för att detektera toppen (röd) och basen (grön) för fluorescerande svar ^12. Mätningen av basen fluorescens ger information av både den mörka strömmen hos lavinfotodiod och störningarna som införs genom omgivnings light och elektromagnetisk koppling. En representation av toppar och baser visas i figur 2c. Denna figur illustrerar den fluorescens som emitteras av färgämnet (Rhod-2) bundet till Ca ^{2 +} under hjärtcykeln av stryk undulat hjärta.

I den andra metoden, är utspänningen från integratorn en funktion av strömmen och kapacitiv återkoppling (figurerna 2d, 2e och 2f). Figur 2F visar två på varandra följande cykler integration: den första utan ytterbelysning och andra med pålagda ljuspulser från en pulsad LED. En detaljerad beskrivning presenteras i figurerna 2g och 2h. Detta tillvägagångssätt, även om mer arbetskrävande, ger en större S / N på grund av frånvaron av termiskt brus i återkopplingskondensator. Instrumentet innehåller en tidssteg som genererar all kontroll och multiplexering av excitationsljuset och beordrar huvudsteg integration och reset perioder. Detta utförs vanligtvis med en digital signalbehandlingskrets som även utför en digital differentiering av den integrerade utsignalen genom att beräkna en on-line regression av data. I fallet med användning av en resistiv återkoppling, kan vilken som helst A / D-upptagningskortet.

Slutligen är vår LFFM teknik mycket mångsidig och kan anpassas för att spela in från mer än en region. Tillsats av en stråldelare i strålgången tillåter oss att dela upp ljuset i två optiska fibrer. Varje optisk fiber kan sedan placeras på olika regioner i en servett för att oberoende excitera och emissions rekord från exogena fluorescerande prober. Denna ändring gör det möjligt för oss att bedöma hur anatomiska regionala skillnader påverkar fysiologiska variabler. Figur 3 visar en stråldelare som utnyttjas för att dela upp CW excitationsljus så att två optiska fibrer används för att mäta transmural elektrisk eller intracellulär [Ca2 ^+] nivåer with moll-invasivt. Transmural signaler kan spelas in genom att placera en fiber på endokardium och den andra på epikardium lagret av kammarväggen. Därför har de LFFM teknik möjligheten att mäta tidsförloppet av cellulära signaler i olika regioner och kan användas för att testa om regionala förändringar inträffa under patologiska situationer.

Protocol

Detta protokoll och alla möss hantering godkändes av UC Merced Institutional Animal Care och användning kommittén (nr 2008-201). Experiment med parakiter genomfördes under 1999 enligt allmänna riktlinjer för djur som fastställts av vetenskapliga uppdrag av venezuelanska Institute for Scientific Research (Ivic). 1. Langendorff Ställande Förberedelse Förbereda Tyrode-lösning innehållande följande lösta koncentrationer i mM: 140 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 <su…

Representative Results

AP och Ca2 + transienter i endokardium och epikardium För att kunna jämföra signaler över den ventrikulära väggen, är en fiberoptisk positionerad i endokardiet och den andra i epikardium. Att jämföra morfologin hos en AP registrerades från endokardiet med ett från epikardium är det bästa sättet att bedöma transmural funktion. Den ventrikulära väggen ä…

Discussion

Detta papper är centrerad vid beskrivning lokala fält fluorescenstekniker för att utvärdera funktionen av hjärtmyocyter ex vivo. Studiet av dessa celler i en kopplad miljö är inte bara mer fysiologisk, men är också mycket lämpligt för att bedöma organnivå patologier. De cellulära händelser som ligger till grund excitation-kontraktion koppling (ECC) kan utvärderas på hela organnivå med hjälp av molekylära prober som övervakar intracellulära Ca2 ⁺ dynamik (Rhod 2 cytosoliskt Ca2 <…

Materials

Sodium chloride	Sigma	7647-14-5
D-(+)-glucose	Sigma	50-99-7
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7
HEPES	Sigma	7365-45-9
Sodium phosphate	Sigma	10049-21-5
Calcium chloride solution	Sigma	10043-52-4
Magnesium chloride solution	Sigma	7786-30-3
Sodium hyrdoxide	Sigma	S-8045
0.2um nylon membrane filter	Whatman	7402-004
Manifold MPP	Warner	64-0216
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
Black Braided silk string (non-absorbable surgical suture)	AllMech Tech	LOOK-SP105
Heparin sodium injection 1000USP/mL	AllMech Tech	NDC63323-540-11
DMSO D8779	Sigma	67-68-5
Blebbistatin	Sigma	856925-71-8
Pluronic F-127 20% solution	Biotium	59004
Materflex C/L peristaltic pump	Cole-Parmer	77122-26
Isostim stimulator	World Precision Instruments	A320RC
Waveform generator	Teledyne Lecroy	WaveStation 2012
Ultrasonic cleaner FS20	Fisher Scientific	1533530
Tygon tubing ID:1/32" OD:3/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-031A
Tygon tubing ID:3/32" OD:5/32" Wall 1/32"	Component Supply	TET-094A
Adapter luer lock to 3-way valve	Cole-Parmer	EW-31200-80
Tee adapters and plastic fittings	Cole-Parmer	6365-90
Plastic clamp	WaterZoo	2465
Peltier	TE Technology	TE-127-2.0-2.5
Rhod-2AM	ThermoFisher Scientific	R1245MP
Di-8-ANEPPS	ThermoFisher Scientific	D3167
Mag-Fluo-4AM	ThermoFisher Scientific	M14206
Acupunture needles	LHASA	TC1.20×13
60mL BD syringe with luer-lok	Fisher Scientific	14-820-11
LabView	National Instruments
Speed vacuum Eppendorf Vagufuge	Fisher Scientific	07-748-13
Digital signal processing circuit DSP TMS 320	Texas Instrument
Longpass Dichroic mirror 567nm	ThorLabs	DMLP567L
Objective 10X NA 0.25 DIN AchromaticFinite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-437
Objective 20X NA 0.40 DIN Achromatic Finite Intl Standard Objective	Edmund Optics	Stock# 33-438
Longpass colored glass filter 590 nm	ThorLabs	FGL590
Green Nd-YAG laser 532nm, 500mW
Micromanipulator for laser	Siskiyou	MX130R
Multimode fiber optic 200µm NA 0.39	ThorLabs	FT200UMT
LEDs blue	Lumileds	L135-B475003500000
LEDs green	Lumileds	L135-G525003500000
Cube beam splitter, non-polarizing	ThorLabs	BS007
36" Length, Dovetail Optical Rail	Edmund Optics	54-402
2.5" Width, Dovetail Carrier	Edmund Optics	54-404
0.75" Travel, micrometer stage	Edmund Optics	37-983
Dovetail optical rail 3"	ThorLabs	RLA075/M
Dovetail rail carrier 1"	ThorLabs	RC1
Avalanche photodiode Helix 902	Digi-Key	HELIX-902-200
Objective holder XY Translator	ThorLabs	ST1XY-S
Aluminum breadboard 6"x6"	ThorLabs	MB6
Nexus otpical table 4'x6'	ThorLabs	T46HK
Stainless steel cap screws	ThorLabs	HW-KIT5/M
Acrylic  sheet	Home Depot/Lowes
Sylgard Silicone elastomer kit	Dow Corning	Sylgard 184
Epoxy gel	Walmart/Home Depot	2-part 5 min clr 1oz
21G1.5 Precision glide needle	B-D	305167
23G Precision glide needle	B-D	305145
Mounting base, 25mmx75mmx10mm	ThorLabs	BA1/M
Wire shelve posts 36"	Alera	AALESW59PO36SR
Wire shelves	Alera	ALESW582424SR
Post and angle clamp	ThorLabs	SWC/M-P5
Glass syringe for dye chamber	Wheaton	W851020
Rubber stopper	Home Science Tools	CE-STOP01C